果蝇睡眠状态分类揭示稳态与昼夜节律调控新机制

《Current Biology》：Recognition of distinct sleep states in Drosophila uncovers previously obscured homeostatic and circadian control of sleep

本研究针对传统单一睡眠定义无法准确反映稳态调控的问题，通过行为学 inactivity 时长标准对果蝇睡眠状态进行细分，发现长时睡眠（>60 min）是稳态睡眠的关键标志，其启动概率与清醒时长呈正相关，且剥夺实验表明只有长时睡眠存在显著反弹。该研究为解析睡眠调控的遗传机制提供了新范式。

　　

睡眠占据人类生命近三分之一的时间，而哺乳动物的睡眠研究早已证实睡眠存在不同阶段（如非快速眼动睡眠和快速眼动睡眠），这些阶段具有不同的生理特征和调控机制。然而，在果蝇这一重要的睡眠研究模式生物中，过去25年来一直采用单一标准定义睡眠——即任何持续5分钟以上的行为静止状态。这种简化处理虽然便于高通量筛选，却可能掩盖了睡眠调控的核心特征。近年来，多项研究通过脑电记录、代谢分析等技术暗示果蝇可能存在不同的睡眠状态，但复杂的技术门槛限制了其广泛应用。

为突破这一瓶颈，Abhilash 等人开展了一项创新研究，旨在通过简单的行为学指标对果蝇睡眠状态进行区分。研究人员基于前期研究发现——静止持续时间与代谢率下降、局部场电位变化等生理指标存在关联，设定了三个睡眠状态的临时划分标准：短时睡眠（5-30分钟）、中时睡眠（30-60分钟）和长时睡眠（>60分钟）。

通过将这种基于时长的分类与先前采用隐藏马尔可夫模型（Hidden Markov Model, HMM）识别出的睡眠状态进行波形对比，研究人员发现两者高度一致。在光暗周期（Light/Dark cycle, LD）和恒定黑暗（Constant Darkness, DD）条件下，短时睡眠和中时睡眠主要在白天或主观白天出现，而长时睡眠则集中在夜间或主观夜间，尤其是在最大的清醒活动峰值之后立即启动。这种时间分布模式提示长时睡眠与睡眠稳态调控关系更为密切。

进一步分析睡眠启动概率显示，长时睡眠的启动概率在主要活动峰值后显著升高，而短时和中时睡眠则无此规律。在睡眠剥夺实验中，只有长时睡眠表现出明显的反弹效应（超过2小时），而短时和中时睡眠反而减少。值得注意的是，使用传统单一睡眠定义（即所有≥5分钟静止）时，睡眠反弹被掩盖，这直接证明传统方法无法准确捕捉稳态调节。对已知睡眠突变体shaker^mns的分析进一步验证了这一观点：仅在区分睡眠状态后，该突变体才表现出长时睡眠反弹受损的表型。

研究还发现，不同睡眠状态具有独特的超日节律（ultradian rhythm）特征，且这些节律的幅度受到昼夜钟的调控。在钟基因突变体per⁰¹中，超日节律的幅度振荡消失，表明昼夜钟对不同睡眠状态的时序编排起关键作用。

关键实验方法

研究利用果蝇活动监测系统（Drosophila Activity Monitoring system）记录行为数据，通过设定静止时长阈值对睡眠状态进行分类；采用涡旋振荡器进行24小时睡眠剥夺；通过波形比较、启动概率分析、圆形统计及连续小波变换（Continuous Wavelet Transform）等方法分析睡眠状态的时序特征和节律性；使用χ2周期图检验超日节律的显著性。

睡眠状态波形与HMM状态高度相似

通过对比基于时长分类的睡眠状态波形与HMM推导的睡眠状态，发现两者在LD和DD条件下均高度一致，说明简单的行为学标准能够有效区分不同的睡眠状态。

长时睡眠启动紧随主要清醒期

在LD、DD和紫外-蓝光阻断的渐变光周期下，长时睡眠的启动概率均在主要活动峰值后立即达到最高，且与活动时长相依存，表明其受稳态调控程度最深。

睡眠剥夺仅引发长时睡眠反弹

机械睡眠剥夺后，长时睡眠出现显著反弹，而短时和中时睡眠则减少。传统单一睡眠定义无法检测到这一反弹，证明其模糊了稳态调节信号。

睡眠突变体表型在状态区分后显现

在shaker^mns突变体中，传统睡眠定义未发现反弹异常，但状态特异性分析显示其长时睡眠反弹显著受损，短时睡眠反弹增强，提示该基因特异性影响长时睡眠稳态。

睡眠状态超日节律受昼夜钟门控

小波分析显示，短时和中时睡眠的超日节律幅度在主观白天较高，而长时睡眠在主观夜间较高。在per⁰¹突变体中，这种节律性幅度振荡消失，证明昼夜钟对不同睡眠状态的超日振荡起门控作用。

本研究通过简单的行为学标准成功识别出果蝇的三种睡眠状态，并证实长时睡眠是稳态调节的关键载体。传统单一睡眠定义不仅掩盖了睡眠剥夺后的反弹效应，还可能导致对睡眠突变体表型的误判。研究强调，未来利用果蝇模型探索睡眠调控的遗传和神经机制时，必须考虑睡眠状态的异质性。这一发现为理解睡眠的进化保守性及开发相关睡眠障碍的治疗策略提供了重要理论基础。该论文发表于《Current Biology》。