《BIOMATERIALS RESEARCH》：Transgene-Free Direct Osteogenic Reprogramming Using Cell-Permeable Octamer-Binding Transcription Factor 4/Core-Binding Factor β Fusion Proteins
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本研究针对骨相关疾病治疗中可靠成骨细胞来源有限的问题，开发了一种基于30Kc19蛋白融合的Oct4/Cbfβ直接重编程平台，成功将人真皮成纤维细胞转化为功能性成骨细胞。该策略通过蛋白递送规避基因组整合风险，在体外和体内实验中均展现出优异的成骨能力和治疗潜力，为骨再生医学提供了更安全高效的解决方案。
骨组织作为人体的结构支架，在维持机体运动和保护内脏器官方面发挥着不可替代的作用。然而随着年龄增长，骨质疏松和骨折等骨相关疾病日益成为困扰人类健康的重大临床难题。传统治疗方法如自体骨移植虽被视为金标准，但存在供区并发症、来源有限等局限性；而细胞疗法虽具潜力，却面临伦理争议、生产成本高以及细胞扩增能力有限等瓶颈。
在细胞命运调控领域，诱导多能干细胞（iPSC）技术的出现曾为再生医学带来革命性突破。但该技术需要经过多能性中间状态，不仅延长了细胞制备周期，更增加了肿瘤形成风险。相比之下，直接重编程技术通过绕过多能阶段，直接将体细胞转化为目标细胞类型，大大缩短了重编程时间并降低了致癌风险。然而，如何实现重编程因子的安全高效递送，始终是制约该技术发展的核心难题。
目前主流的重编程方法多依赖于病毒载体、质粒DNA或小分子化合物。病毒载体虽然转染效率高，但存在插入突变的风险；而非整合型平台虽然安全性有所提高，却往往面临转基因表达不稳定、重编程因子持续时间短等问题。蛋白质重编程作为完全规避基因组整合的理想策略，又受限于蛋白质溶解性差、易降解和细胞摄取效率低等挑战。
为解决这些难题，研究团队将目光投向了一种来自家蚕的独特蛋白——30Kc19。这种蛋白被证明能够作为多功能融合伴侣，同时提升融合蛋白的细胞穿透性、可溶性表达和细胞内稳定性。研究人员创新性地将30Kc19与两个关键成骨诱导因子Oct4和Cbfβ进行融合，构建了具有细胞穿透能力的重组蛋白Oct4-30Kc19和Cbfβ-30Kc19。
Oct4是维持细胞多能性的核心转录因子，能够诱导体细胞进入表观遗传"可塑性状态"；而Cbfβ作为Runx转录因子家族的非DNA结合辅因子，对成骨细胞分化和骨基质沉积至关重要。研究团队假设，通过Oct4诱导细胞可塑性和Cbfβ驱动成骨分化的协同作用，可实现高效、特异的成骨重编程。
关键技术方法方面，研究人员首先通过大肠杆菌表达系统制备重组融合蛋白，利用组氨酸标签进行纯化。采用免疫荧光染色评估蛋白的细胞摄取和细胞内稳定性，通过碱性磷酸酶（ALP）染色、阿尔新红（ARS）染色和OsteoImage矿化实验评估成骨分化效果。通过QuantSeq 3′mRNA测序分析转录组变化，并使用小鼠颅骨缺损模型结合微计算机断层扫描（micro-CT）和组织学分析评估体内骨再生能力。
研究结果方面：
直接细胞重编程验证表明，Oct4和Cbfβ的共表达在质粒转染系统中能协同诱导人真皮成纤维细胞（HDF）向成骨细胞分化，表现为ALP活性升高、钙沉积增加以及成骨标志物骨桥蛋白（OPN）和骨钙素（OCN）的表达。
重组蛋白制备与安全性评估显示，30Kc19融合显著改善了Oct4和Cbfβ在大肠杆菌中的可溶性表达，且预测的三维结构表明融合后蛋白天然构象得以保持。细胞毒性实验证实，即使在较高浓度下重复处理，融合蛋白对细胞活力影响甚微。
细胞穿透特性研究发现，30Kc19融合蛋白能在30分钟内被细胞有效摄取，1小时后广泛分布于胞质，8小时后进入细胞核。与质粒转染相比，蛋白递送实现了更高比例细胞的因子共递送，且细胞内稳定性可持续24小时以上。
功能成骨细胞生成实验证明，经过8个周期的蛋白处理，Oct4-30Kc19和Cbfβ-30Kc19协同诱导了显著的矿化基质形成，其效率显著高于单因子处理或质粒转染组。
转录组分析显示，蛋白诱导的成骨细胞（piOB）与原始HDF相比有3，171个差异表达基因，这些基因显著富集于转录调控相关通路。piOB的转录组特征与原发性人成骨细胞（hOB）更为接近，且多个成骨相关基因如BMP2和TMEM38B表达上调。
体内骨再生评估发现，将piOB接种于明胶冷冻凝胶支架后移植到小鼠颅骨缺损处，8周后micro-CT和组织学分析显示实验组缺损区域有显著的新骨形成，骨体积分数（BV/TV）增加，骨小梁分离度降低，且OPN和OCN表达阳性。
研究结论与讨论部分指出，该研究建立的蛋白质直接重编程平台通过30Kc19融合技术，成功解决了蛋白质递送中的稳定性、溶解性和细胞摄取效率等关键问题。仅使用两个重编程因子即实现高效成骨转化，相比传统方法更为简化安全。转录组分析证实了细胞命运的实质性转变，而体内实验则展示了其治疗潜力。特别值得关注的是，该策略采用了"部分预重编程结合体内成熟"的新思路，利用宿主微环境信号促进移植细胞的终末成熟，这为细胞治疗提供了新范式。
该研究的创新性在于：首先，30Kc19融合技术为蛋白质递送提供了综合解决方案；其次，双因子策略在保证效率的同时大幅简化了重编程体系；最后，体内外实验验证了该平台的实际应用价值。这些特点使得该技术在未来骨再生医学中具有广阔的转化前景，特别是为开发无基因组整合风险的细胞治疗产品提供了新思路。
虽然研究未直接证实体内重编程的可行性，但蛋白质的优异特性为其体内应用奠定了基础。未来通过添加靶向骨组织的分子标签，有望进一步提高其在体内的特异性和效率。总之，这项研究为骨相关疾病的细胞治疗提供了一种更安全、高效且易于标准化的新策略，对推动再生医学发展具有重要意义。
