非洲猪瘟病毒CD2v蛋白通过激活TPL2-MEK-ERK信号通路诱导BimEL降解抑制细胞凋亡的机制研究

《Journal of Virology》：The ASFV CD2v protein inhibits apoptosis by inducing proteasomal degradation of BimEL via activation of the TPL2-MEK-ERK signaling pathway

本研究揭示了非洲猪瘟病毒（ASFV）CD2v蛋白通过激活TPL2-MEK-ERK信号轴，诱导促凋亡蛋白BimEL的蛋白酶体降解，从而在感染细胞和未感染旁观者细胞中双重抑制细胞凋亡的新机制。该发现不仅阐明了CD2v蛋白的多功能抗凋亡策略，为ASFV免疫逃逸机制提供了新见解，更为开发靶向病毒-宿主互作的抗病毒疗法提供了潜在靶点。

　　

非洲猪瘟病毒（ASFV）CD2v蛋白抑制细胞凋亡的机制研究

摘要

非洲猪瘟病毒采用精妙的调控策略操纵宿主细胞凋亡，这一过程对其致病性和免疫逃逸至关重要。本研究发现ASFV编码的包膜蛋白CD2v通过激活TPL2（肿瘤进展位点2）-MEK（丝裂原活化蛋白激酶激酶）-ERK（细胞外信号调节激酶）信号轴，导致促凋亡蛋白Bim_EL在原代猪肺泡巨噬细胞和野猪肺细胞中发生蛋白酶体降解。值得注意的是，从感染细胞释放的可溶性CD2v还能在未感染的旁观者细胞中激活该信号通路，建立有利于病毒传播的促生存微环境。

引言

非洲猪瘟是由ASFV引起的高度致死性传染病，高致病性毒株可导致近100%死亡率。ASFV对单核吞噬细胞系统具有显著嗜性，其诱导的广泛细胞凋亡在病理损伤中起关键作用。细胞凋亡作为宿主对抗细胞内病原体的重要防御机制，由Bcl-2蛋白家族精密调控。其中BH3-only蛋白Bim通过中和抗凋亡蛋白或直接激活Bax/Bak来启动线粒体凋亡途径。尽管已知多个ASFV蛋白具有调控凋亡的功能，但CD2v在凋亡调控中表现出双重作用，其具体分子机制尚未完全阐明。

ASFV感染下调宿主细胞中促凋亡蛋白Bim_EL

通过检测关键Bcl-2家族成员表达发现，ASFV感染在猪肺泡巨噬细胞和野猪肺细胞中均特异性下调Bim_EL（Bim额外长亚型）蛋白水平。在猪肺泡巨噬细胞中，感染还导致Bcl-xL下调、Bcl-2上调和Bax激活；而在野猪肺细胞中则呈现Bcl-2下调，Bax和Bcl-xL表达稳定的差异化调控模式。

宿主细胞Bim_EL水平与ASFV诱导的细胞凋亡正相关

功能实验表明，过表达Bim显著增强ASFV感染引起的cCASP3（切割型 caspase-3）产生和细胞凋亡；而通过siRNA敲低或CRISPR-Cas9敲除Bim则显著抑制细胞凋亡。值得注意的是，Bim敲除细胞中ASFV复制显著增强，证实Bim_EL不仅促进ASFV诱导的细胞凋亡，同时限制病毒复制。

ASFV通过ERK1/2依赖性磷酸化触发Bim_EL的蛋白酶体降解

机制探索发现，ASFV感染并不改变Bim转录水平，但蛋白酶体抑制剂MG132可阻断Bim_EL下调。进一步研究证实ASFV感染诱导ERK1/2磷酸化，并促进Bim_EL第69位丝氨酸磷酸化。使用MEK1/2抑制剂Selumetinib处理可同时抑制ERK1/2活化和Bim_EL降解，表明ASFV通过激活ERK1/2信号促进Bim_EL的蛋白酶体降解。

抑制ERK1/2信号通路增强ASFV诱导的细胞凋亡

药理实验显示，Selumetinib处理显著增强ASFV感染引起的cCASP3水平和细胞凋亡率，证实ERK1/2通路激活在抑制ASFV诱导的细胞凋亡中发挥关键作用。

ERK1/2信号通路过度激活抑制ASFV复制

有趣的是，虽然ERK1/2通路抑制不影响病毒复制，但使用PMA（佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯）过度激活ERK1/2可浓度依赖性地抑制ASFV复制。这表明ERK1/2通路在ASFV感染中具有双重功能：一方面通过降解Bim_EL抑制凋亡促进病毒存活，另一方面可能通过激活炎症反应限制病毒复制。

ASFV不依赖病毒复制激活TPL2-MEK-ERK信号轴

通过热灭活病毒、超速离心纯化等实验证实，ASFV病毒粒子本身即可激活ERK1/2信号。通路抑制剂实验进一步表明，ASFV通过TPL2而非RAF激酶激活MEK-ERK信号级联，这一过程不依赖病毒复制能力。

ASFV CD2v蛋白驱动Bim_EL降解及凋亡抑制

通过AP-1荧光素酶报告基因系统筛选33个ASFV结构蛋白，发现CD2v是最强的AP-1转录激活因子。机制研究表明，CD2v通过MEK-ERK（而非JNK或p38）通路激活AP-1，且这一过程不依赖细胞内化。关键证据来自CD2v基因敲除病毒（ASFV-ΔCD2v）的构建，该突变体几乎完全丧失诱导ERK1/2活化和Bim_EL降解的能力。

讨论

本研究首次阐明ASFV CD2v蛋白通过激活TPL2-MEK-ERK信号轴诱导Bim_EL蛋白酶体降解的双重抗凋亡机制。值得注意的是，CD2v以病毒粒子结合形式和可溶性形式分别调控感染细胞和旁观者细胞的凋亡，这种多模式作用机制有助于病毒建立促生存微环境。尽管ERK1/2通路激活对ASFV复制的影响具有复杂性，但CD2v介导的Bim_EL降解无疑是ASFV免疫逃逸策略的关键环节。该发现不仅拓展了对CD2v蛋白功能多样性的认识，也为ASFV致病机制研究提供了新视角。