《Agriculture, Ecosystems & Environment》：Coupled shifts in phosphorus fractions and P-cycling genes driven by long-term cattle manure amendment across the 0–40?cm profile of a Mollisol
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本研究针对长期单一施用化肥导致土壤磷（P）有效性降低及微生物功能失衡的问题，通过12年田间试验结合宏基因组学技术，揭示了牛粪替代部分化肥如何重塑黑土不同深度（0-40 cm）的磷组分分布和微生物磷代谢功能基因网络。结果表明，牛粪添加显著提升了土壤总磷及各形态磷库（如Resin-Pi、NaHCO3-Pi等），并增强了无机磷溶解基因（如gcd、ppk1）和有机磷矿化基因（如phoD）的丰度，同时抑制了磷饥饿响应基因（如phoR）。研究首次发现深层土壤（20-40 cm）蕴藏了如Nitrospirae、Chloroflexi等具有独特磷代谢潜力的微生物类群，并通过构建高质量宏基因组组装基因组（MAGs）揭示了Pseudomonadota等关键菌门的磷循环功能冗余策略。该成果为通过有机-无机配施实现土壤磷素高效利用和微生物调控提供了理论依据，对推动农业可持续发展具有重要意义。
在当今全球粮食需求持续增长的背景下，农业的集约化生产高度依赖化学肥料的大量投入。然而，长期单一使用无机肥料不仅会破坏土壤生态系统的物质循环平衡，还可能导致土壤有机质下降和养分利用效率降低。磷（P）作为植物生长发育不可或缺的营养元素，是ATP、磷脂、DNA和RNA等生物大分子的关键组成部分。但土壤中的磷极易被金属离子（如Al、Fe、Ca）固定或吸附在矿物表面，使其有效性大大降低，这成为限制作物产量的一个重要因素。更为棘手的是，全球磷矿资源有限且分布不均，如何高效利用土壤中的磷、挖掘其潜在供应能力，是农业可持续发展面临的重大挑战。
微生物在土壤磷循环中扮演着核心角色。它们通过分泌有机酸、酶等物质，驱动无机磷的溶解、有机磷的矿化、磷的固定以及磷的吸收转运等一系列过程。这些过程主要由微生物体内的功能基因群所控制，例如调控磷饥饿反应的双组分系统基因phoR和phoB，编码碱性磷酸酶的phoD基因，以及编码多聚磷酸盐激酶的ppk基因等。理解这些功能基因如何响应不同的施肥管理措施，以及它们与土壤磷有效性的关系，对于优化养分管理、提升土壤健康至关重要。
以往的研究多集中于施肥对耕层土壤（例如0-20 cm）磷状况的影响，而对深层土壤（20 cm以下）的磷库及其驱动微生物的关注较少。事实上，当表层土壤磷被耗尽或被固定时，作物所需磷的相当大比例（可达80%）可能来自于深层土壤的储备。因此，评估不同深度土壤的磷循环过程及其作为作物磷源的可能性，具有重要的理论和实践意义。有机肥（如牲畜粪肥）的施用被认为是改善土壤肥力、增加有机质和促进养分循环的有效措施。已有研究表明，有机肥能增强碱性磷酸酶活性，提高phoD基因的丰度。但是，关于在长期施用化肥的基础上增施有机肥，如何影响土壤剖面不同深度的磷组分动态和微生物磷代谢功能基因网络，仍缺乏系统的研究。
为了解决上述问题，一篇发表在《Agriculture, Ecosystems & Environment》上的研究论文，对中国东北黑土区一个经历了42年（30年化肥基础 + 12年试验处理）不同施肥管理的田间试验进行了深入剖析。研究人员旨在探究长期化肥配施牛粪对黑土0-40 cm剖面磷组分分布和微生物磷循环功能基因的影响。他们提出了两个关键科学假设：第一，有机肥的添加将通过改变微生物功能基因谱来提高土壤磷的生物有效性；第二，长期的施肥管理会诱导产生垂直分层的磷循环微生物群落，其响应在表层土壤（0-20 cm）更为明显，但在深层土壤可能存在独特的适应机制。
为了验证这些假设，研究团队在玉米收获后，从四个土壤深度（0-10 cm, 10-20 cm, 20-30 cm, 30-40 cm）采集了土壤样品。这些样品来自四个不同的处理：不施肥（CK）、仅施化肥（CF）、化肥配施低量牛粪（15 Mg ha-1year-1, FM1）以及化肥配施高量牛粪（30 Mg ha-1year-1, FM2）。研究采用了Hedley磷分级法系统分析了10种不同的磷组分，并运用宏基因组鸟枪法测序技术，对土壤微生物群落的组成和功能潜力进行了全面解析。关键技术方法包括：土壤磷组分的化学分析、环境DNA的提取与高质量宏基因组测序、基于KEGG等数据库的功能基因注释与相对丰度计算、微生物群落多样性（α和β多样性）分析、功能基因共现网络构建、以及高质量宏基因组组装基因组（MAGs）的构建与功能注释。通过统计学方法（如ANOVA、PCoA、Mantel test等）分析了施肥处理、土壤深度与各测量指标之间的关系。
3.1. 不同施肥制度下黑土不同深度土壤磷组分的变化
研究结果清晰地表明，长期施肥显著改变了土壤磷组分的分布，这种影响在0-20 cm的上层土壤中最为显著。与CF处理相比，不施肥的CK处理导致0-10 cm和10-20 cm土层总磷（TP）浓度显著降低。相反，FM1和FM2处理则显著增加了这些上层土壤的TP浓度，其中FM2处理在表层土壤中积累了最多的磷。在更深的土层（20-40 cm），不同施肥处理间的TP差异变得不显著。牛粪的施用还显著提高了植物最易利用的无机磷（AEM-Pi和H2O-Po）以及NaHCO3-Pi在0-20 cm土层的浓度。此外，牛粪处理也促进了中等活性磷（如NaOH-Pi, 主要代表铁铝氧化物结合态磷）和难溶性磷（如HCl-Pi, 主要代表钙结合态磷；以及最稳定的Residual-P）在表层土壤的积累。这说明牛粪的施用不仅提高了土壤磷的即时有效性，也增强了土壤长期磷库的储备能力。
3.2. 参与磷循环的微生物群落的Alpha/Beta多样性及组成
宏基因组测序分析显示，与CK相比，CF、FM1和FM2施肥处理均降低了所有土层微生物功能基因的α多样性（Shannon指数）。然而，FM2处理在0-10 cm和20-30 cm土层显著提高了Shannon指数。主坐标分析（PCoA）表明，除20-30 cm土层外，不同施肥管理12年后，磷相关功能群落出现了明显的分化。在所有处理中，参与磷循环的优势菌门（相对丰度前5）均为变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）和芽单胞菌门（Gemmatimonadetes），它们共同占总量的80%以上。牛粪处理（FM1和FM2）增加了0-20 cm土层中变形菌门的丰度，而化肥和牛粪处理降低了酸杆菌门的丰度，但增加了绿弯菌门和疣微菌门（Verrucomicrobia）的丰度。值得注意的是，一些菌门如Candidatus Rokubacteria、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）和绿弯菌门（Chloroflexi）的丰度从表层土到底层土呈现增加趋势，表明深层土壤可能蕴藏着更多新颖的微生物谱系。
3.3. 关键磷循环功能基因对不同施肥处理的响应
研究共鉴定出47个磷相关基因，并将其归为四类功能模块：无机磷溶解、有机磷矿化、磷饥饿响应调控以及磷吸收转运。FM1和FM2处理增加了无机磷溶解基因（如gcd, ppk1, ppx）的总相对丰度，特别是在0-10 cm和30-40 cm土层；同时，在所有土层均降低了磷饥饿响应调控基因（如phoR, phoB, phoU）的丰度。化肥单独施用（CF）增加了pit和pstB（磷吸收转运）的丰度，但降低了phnC/D/E的丰度。对于有机磷矿化基因，CF处理降低了phoD的丰度，而FM1和FM2处理则提高了其丰度。相关性分析显示，在表层土壤中，gcd基因的丰度与有效磷组分呈正相关；而在深层土壤中，ppk1、ppa和ppx基因的丰度与无机磷溶解正相关，表明不同深度的土壤中主导磷溶解过程的基因可能不同。
3.4. 功能磷基因的共现网络
基因共现网络分析揭示了施肥处理对磷循环基因间相互作用的影响。在0-10 cm土层，CF处理导致了最高的网络拓扑参数（节点数、连接数等）。FM1和FM2处理则显示出比CK更高的平均度、平均路径长度和正相关连接数。在10-20 cm土层，CF处理再次领先。而在20-30 cm土层，FM1和FM2处理具有更高的节点数、连接数等网络复杂性指标。到了30-40 cm深层土壤，施肥效应减弱，CK处理反而拥有最复杂的网络结构。这些结果表明，施肥对微生物功能基因网络结构的影响随着土壤深度的增加而减弱，深层土壤的微生物基因网络可能具有其独特的、受干扰较小的生态位。
3.5. 土壤磷组分、磷循环基因与土壤性质之间的关联
Mantel检验和相关性热图分析表明，大多数磷组分的浓度与土壤碳氮比（C/N）、硝态氮（NO3--N）和铵态氮（NH4+-N）水平呈正相关。具体到基因，gcd的丰度与磷组分呈正相关。对于有机磷矿化过程，phoN、aceK、phoD、glpQ等基因的丰度与磷组分正相关，而phnG、glpA等基因的丰度则呈负相关。磷饥饿响应调控基因phoB和phoR的丰度与磷组分负相关。这些复杂的相关关系揭示了微生物功能基因与土壤磷循环过程之间紧密而多样的联系。
3.6. 涉及磷循环的宏基因组组装基因组（MAGs）
研究成功构建了18个高质量MAGs（完整度>90%，污染度<10%），它们分属于热变形菌门（Thermoproteota，即原来的奇古菌门Thaumarchaeota）、放线菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）、假单胞菌门（Pseudomonadota）和脱硫杆菌门（Desulfobacterota）。这些MAGs广泛携带了参与四个磷循环过程的基因。基因拷贝数分析显示存在功能冗余，例如glpQ基因在某些MAG中拷贝数最高（达7-8个）。隶属于假单胞菌门的MAGs（如MAG106, 162, 261, 271, 345）在化肥和有机肥处理下，其磷吸收转运和磷饥饿响应相关基因的冗余度表现出敏感的变化，但响应模式各异，表明该菌门成员在维持土壤磷循环功能上具有重要的功能弹性和多样性。
该研究的结论部分总结道，长期化肥配施牛粪的管理措施显著影响了黑土的磷组分和土壤微生物组的磷代谢能力。有机肥的添加优化了微生物的磷动员功能，其效果优于单施化肥。表层土壤的微生物多样性和基因丰度对施肥的响应更为强烈，而深层土壤则蕴藏着具有寡营养适应策略的独特类群（如Nitrospirae, Chloroflexi），这些类群的MAGs富含磷饥饿响应基因。研究还拓展了人们对磷循环微生物多样性的认知，特别是发现了古菌（Thermoproteota）在土壤磷循环中的潜在重要作用。构建的MAGs为了解关键微生物类群的磷循环功能提供了宝贵的基因组资源。
在讨论中，作者将本研究结果与全球范围内的长期肥料试验结果进行了对比，进一步证实了有机肥在提升土壤全磷和有效磷库方面的独特优势。作者重点探讨了不同菌门（如Thermoproteota, Pseudomonadota）在磷循环中的潜在功能及其对不同土壤深度的适应策略。特别指出，像gcd、ppk1和phoD这样的关键基因，可以作为不同土层磷活化能力的潜在生物标志物。此外，深层土壤微生物群落作为尚未被充分开发的磷动员资源库，其价值值得进一步关注。
综上所述，这项研究通过整合土壤化学与宏基因组学，从剖面尺度深入揭示了有机无机肥配施驱动土壤磷循环微生物机制的耦合过程。它不仅为黑土区优化磷肥管理、提高磷素利用效率提供了重要的科学依据，也强调了在可持续农业实践中，应考虑整个土壤剖面的微生物功能，而不仅仅是耕层土壤。未来的研究应侧重于对深层土壤关键微生物类群的功能进行验证，从而为精准调控土壤磷循环、挖掘土壤自身磷潜力提供新的思路和技术途径。
