《Microbiology Spectrum》：Emergence of Stilbocrea gracilipes associated with canker and dieback in pomegranate and eucalyptus trees and host-specific responses
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本研究发现纤细柱孢菌（Stilbocrea gracilipes）是导致伊朗重要经济作物石榴和景观树种桉树溃疡与顶枯病的病原菌，通过多基因（ITS、tef1-α、rpb2）系统发育分析和致病性测定首次确认其全球性病原地位，并揭示其跨寄主感染能力及石榴品种间的显著抗性差异，对混合种植系统病害防控具有重要警示意义。
ABSTRACT
伊朗法尔斯省商业果园和邻近观赏树木中溃疡病和顶枯病症状的日益增多，促使了对相关真菌病原体的调查。2023年和2024年的调查从有症状的石榴（Punica granatum L.）和桉树（Eucalyptus camaldulensis Dehnh.）上获得了几株分离菌，基于形态学、生理学和多基因位点（ITS、tef1-α和rpb2）系统发育分析，将其鉴定为纤细柱孢菌（Stilbocrea gracilipes）。致病性测试表明，所有回收的S. gracilipes分离菌（n = 23）均能在各自寄主的离体枝条上引起深褐色病斑和木材变色，且侵袭力存在显著差异。使用最具侵袭力的分离菌对石榴和桉树幼苗进行交叉致病性评估显示，来自原始寄主的分离菌对两种植物均具有致病性，能引起特征性病斑和内部木材变色。基于八项致病性性状的评估，来自石榴的分离菌（PM7-68）比来自桉树的分离菌（EU1-031）表现出更强的侵袭力。此外，接种的石榴幼苗比接种的桉树幼苗表现出更高的感病性，凸显了S. gracilipes对具有重要经济意义的石榴园的潜在威胁。利用主成分分析（PCA）和热图可视化评估石榴品种对S. gracilipes分离菌的感病性，将病害严重度聚类为四个不同的组。石榴品种‘Malas-e-Danesiyah-e-Esfahani’ consistently exhibited high disease severity (level 4), identifying it as highly susceptible, while the cultivar ‘Kadro’ displayed reduced lesion development and slower disease progression (level 1), suggesting relative resistance.
IMPORTANCE
这项研究首次报道了纤细柱孢菌（Stilbocrea gracilipes）与石榴和桉树的溃疡病和顶枯病相关，并且首次在伊朗和全球范围内确认了其作为木本寄主溃疡病致病真菌的致病性。S. gracilipes能够侵染果树和观赏树木，加之其跨寄主感染能力，对混合种植系统和自然生态系统构成了潜在风险。
INTRODUCTION
石榴（Punica granatum L.）和桉树（Eucalyptus spp.）分别属于千屈菜科（Lythraceae）和桃金娘科（Myrtaceae），适应性强，能在从热带到亚热带的各种农业气候区茁壮成长。石榴原产于伊朗及邻近地区，具有显著的遗传多样性和对干旱条件的显著耐受性，需水量少且耐贫瘠土壤。2022年，伊朗石榴产量约110万吨，种植面积约9.6万公顷，占全球产量的近五分之一。作为一种具有日益增长的国际需求的宝贵出口作物，石榴从果实消费和加工到其他植物部分的药用和工业应用都具有经济效益。同样，原产于澳大利亚及邻近太平洋岛屿的桉树已被广泛引种到全球。其快速生长、耐旱和理想的木材特性使其成为人工林的热门选择，用作遮荫树、观赏树和防风林。在过去三十年里，桉树人工林在全球范围内扩张，覆盖约2257万公顷。除了木材，桉树还提供有价值的非木材产品，如精油和蜂蜜，并在造纸、家具、能源、木炭和住房方面有工业应用。然而，桉树在其原生范围之外的最初成功，归因于暂时摆脱了天敌，但受到病虫害出现的挑战，威胁着桉树人工林的长期可持续性。
在石榴上，已发现几种真菌类群与溃疡病和顶枯病症状相关，包括丛赤壳科（Bionectriaceae）、葡萄座腔菌科（Botryosphaeriaceae）、壳囊孢科（Cytosporaceae）、蕉孢壳科（Diatrypaceae）、亚隔孢壳科（Didymellaceae）、暗球腔菌科（Didymosphaeriaceae）和Togniniaceae的成员，报告来源于澳大利亚、中国、希腊、伊朗、南非和美国等地。同样，桉树溃疡病归因于多种真菌病原体，特别是葡萄座腔菌科（Botryosphaeriaceae）、隐孢间座壳科（Cryphonectriaceae）和斑痣腔菌科（Teratosphaeriaceae）内的病原体。
在与木本寄主溃疡病和顶枯病相关的多种真菌类群中，柱孢菌属（Stilbocrea，丛赤壳科）的成员因其在多种植物物种中的致病作用而受到越来越多的关注。由Stilbocrea spp.引起的病害表现为各种形式，如木材变色和坏死、溃疡病发生和顶枯病。例如，S. banihashemiana被记录为几种水果和观赏物种溃疡病和顶枯病的致病因子，包括欧洲小檗（Berberis vulgaris L.）、枇杷（Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl.）、无花果（Ficus carica L.）、核桃（Juglans regia L.）和月季（Rosa hybrida L.）。同样，S. colubrensis已被报道与青皮竹（Bambusa vulgaris Schrad. ex J.C.Wendl.）相关。此外，S. gracilipes已从多种基质中分离出来，包括双子叶植物和棕榈树的细枝、树皮和枯木，以及人心果（Manilkara zapota [L.] P.Royen）、刺槐（Robinia pseudoacacia L.）和梭梭（Haloxylon spp.）的顶枯病症状。S. macrostoma已被发现与影响勃兰特栎（Quercus brantii Lindl.）的木材坏死有关。此外，S. walteri已被鉴定与冬青栎（Quercus ilex L.）相关，并且也与柑橘（Citrus spp.）和石榴（P. granatum）树的溃疡病和顶枯病有关。
在最近对伊朗主要石榴产区之一法尔斯省石榴园和景观观赏桉树（Eucalyptus camaldulensis Dehnh.）溃疡病和顶枯病的调查中，从石榴和桉树树的溃疡、顶枯和内部变色木材中回收了几株类似丛赤壳科（Bionectriaceae）的分离菌。基于形态特征，这些分离菌被初步鉴定为柱孢菌属（Stilbocrea）的成员。本研究旨在：（i）表征这些类似丛赤壳科分离菌的形态和培养特征，并进行多基因系统发育分析；（ii）评估所有获得分离菌在各自寄主离体枝条上的致病性和侵袭力；（iii）评估分离菌在自然寄主上的交叉致病性；以及（iv）通过各种致病性性状和稳健的统计分析评估八个石榴品种对这些分离菌的感病性。
RESULTS
Field surveys, disease symptoms, and fungal isolates
对伊朗南部法尔斯省商业石榴园和桉树的田间调查揭示了一种广泛存在的综合征，其特征是枝干溃疡、细枝顶枯、内部变色和整体衰退。我们的观察表明，这种综合征在较老、已建成的种植园中发生率高于新建的、管理良好的果园和景观区。石榴树表现出外部症状，包括树干和成熟枝条上凹陷、拉长的坏死病斑，通常伴有树皮开裂和愈伤组织形成。严重感染导致进行性顶枯、黄化、提早落叶和坏死、整体木材组织腐烂，最终导致树木死亡。桉树在主枝和侧枝上表现出坏死性溃疡，伴有树皮开裂和流胶。两种物种的内部症状包括木材变色、扇形维管束坏死和维管组织中的深褐色斑点，在症状树干和枝条的横切面中可见。从有症状的石榴树（33株分离菌）和桉树（17株分离菌）收集的50株子囊菌分离菌中，有23株被归为类似丛赤壳科的形态型，产生顶生和侧生瓶梗以及丰富的腊肠形和卵形分生孢子。该子集占石榴分离菌的45.4%和桉树分离菌的47.1%。其他回收的分离菌表现出与亚隔孢壳科（Didymellaceae）、肉座菌科（Nectriaceae）和格孢腔菌科（Pleosporaceae）成员一致的形态特征。类似丛赤壳科的分离菌来源于设拉子两个果园的10棵染病石榴树（12株分离菌）、阿尔桑詹县一个果园（3株分离菌），以及设拉子县两个独立地点的四棵桉树（8株分离菌）。来自石榴的分离菌，60%从有症状的成熟枝条回收，26.7%从一年生枝条回收，13.3%从树干回收。来自桉树的分离菌，50%源于成熟枝条，25%源于一年生枝条，25%源于树干。
Morphological characterizations and the effect of temperature on mycelial growth
在PDA上，类似丛赤壳科的分离菌最初产生棉絮状、白色的气生菌丝，随后发育出橄榄灰色中心、橄榄浅黄色中间环和白色边缘。在MEA上观察到类似的模式，菌落开始时为乳白色，随后中央形成致密的白色气生菌丝，外围有分散的菌丝形成。随着时间的推移，气生菌丝转变为橄榄绿色。分生孢子丰富，透明，壁光滑，卵形至腊肠形，直或略微弯曲。腊肠形分生孢子大小为3.73–6.61 × 1.46–2.76 μm（平均4.73 ± 0.6 × 1.96 ± 0.24 μm；n = 90），而卵形分生孢子范围为1.96至2.99 × 1.88–2.62 μm（平均2.37 ± 0.26 × 2.28 ± 0.22 μm；n = 90）。瓶梗顶生和侧生，在气生菌丝上丰富，分枝，基部宽，形状从圆柱形到烧瓶形，大小为6.3–9.43 × 1.94–3.18 μm（平均8.57 ± 0.24 × 2.48 ± 0.2 μm；n = 90）。分生孢子梗单轴分枝一次或两次。温度-生长关系测定显示，在PDA和MEA上，10°C时生长速率最低，最适生长速率在25°C（对于APM2-01和PM7-68）和30°C（对于EU1-031）。此外，在5°C和40°C下，PDA和MEA上未观察到生长。在25°C的PDA上，径向生长速率范围为2.31至4.11 mm/天（平均3.42 ± 0.5 mm/天），在12小时光周期下培养14天后，菌落平均直径达到47.88 mm。在25°C的MEA上，径向生长速率记录为1.95至3.43 mm/天（平均2.87 ± 0.3 mm/天），菌落在14天内达到平均直径40.18 mm。这些形态特征与柱孢菌属（Stilbocrea spp.）成员一致。
Molecular identification and phylogenetic analyses
使用BLASTn进行序列比较显示，从染病石榴和桉树获得的代表性分离菌（APM2-01, EU1-031, 和PM7-68）的ITS、tef1-α和rpb2序列与S. gracilipes分离菌（CBS 301.96 和 CBS 657.83）的核苷酸同一性极高（超过99%）。基于单个基因位点（ITS、tef1和rpb2）及其串联排列的贝叶斯推断（BI）和最大似然法（ML）系统发育分析表明，本研究的柱孢菌属分离菌在丛赤壳科的柱孢菌属分支内聚集在一个得到良好支持的单系谱系中，与S. gracilipes分离菌亲缘关系密切。在串联系统发育树中，该谱系得到了强有力的支持，表现为高自举值（ML为99%）和后验概率（BI为1.00）。本研究获得的分离菌的系统发育位置，结合其独特的形态特征，为其鉴定为S. gracilipes提供了有力支持。
Pathogenicity and aggressiveness assessments of isolates
在石榴和桉树离体枝条上进行的致病性测定中，所有23株S. gracilipes分离菌在接种后15天均引起接种点周围的木材变色，证实了它们对各自寄主的致病作用。方差分析（ANOVA）表明，分离菌间的致病性性状（ULP：向上病斑扩展；DLP：向下病斑扩展；LW：病斑宽度）存在统计学显著差异（P < 0.0001）。随后使用Tukey’s HSD检验分析，确定S. gracilipes分离菌PM7-68对石榴枝条最具侵袭力，导致最大的ULP（25.38 ± 0.5 mm）、DLP（17.80 ± 0.53 mm）和LW（8.32 ± 0.2 mm）。相反，分离菌PM9-62侵袭力最弱，产生的木材病斑尺寸显著较小。在桉树枝条上，分离菌EU1-031引起最广泛的坏死木材病斑（ULP: 81.04 ± 0.46 mm, DLP: 82.67 ± 0.65 mm, LW: 8.48 ± 0.1 mm），而分离菌EU3-04导致的木材病斑尺寸最小。阴性对照在两种寄主物种的接种枝条上均无症状。接种的分离菌成功地从接种的离体枝条中重新分离出来，而对照枝条组织中未回收
