《Microbiology Spectrum》：High-resolution genomics uncovers region-specific evolution and virulence of ocular Streptococcus pneumoniae
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本文通过高分辨率全基因组测序(WGS)首次系统揭示了中国浙江地区与全球眼部感染肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的分子流行病学特征。研究发现亚洲菌株在紫外线损伤修复基因(uvrB)和ATP蛋白酶基因(SP_0338)存在特异性变异，而DNA完整性基因(SP_1247)呈现全球保守性高突变，提示其可能是细菌在紫外线暴露的眼表环境中生存的关键适应性进化。该研究为开发区域特异性疫苗和精准诊疗策略提供了重要基因组学依据。
ABSTRACT
肺炎链球菌是导致威胁视力眼部感染的主要病原体。本研究对中国浙江省及全球数据集(n=58)的眼部肺炎链球菌分离株进行了高分辨率全基因组分析。通过乳胶凝集和Quellung反应鉴定出9种血清型，PCV13疫苗覆盖中国分离株的54.5%，且结膜炎病例中未发现不可分型(NT)菌株。Illumina短读长数据经过从头组装后，进行了耐药性和毒力基因BLAST比对、系统发育分析、重组预测和单核苷酸多态性(SNP)分析。
系统发育分析显示中国分离株呈散发性分布。与西方国家菌株携带mefA基因不同，所有中国菌株均携带ermB基因介导大环内酯类耐药。毒力基因分析发现，与中国角膜炎和结膜炎相关的肺炎链球菌菌株均未检测到zmpC基因。亚洲分离株中SNP和嵌合块的显著积累与获得区域特异性等位基因密切相关，这些基因编码ATP依赖性蛋白酶SP_0338和紫外线损伤修复酶uvrB。值得注意的是，DNA完整性基因SP_1247已成为全球保守且功能重要的眼部肺炎链球菌决定因子。这些发现强调，参与DNA完整性监视和紫外线应激反应的基因富含非同义突变，可能是肺炎链球菌在紫外线暴露的眼表定植的毒力先决条件。
IMPORTANCE
本研究提供了首个眼部肺炎链球菌的高分辨率基因组图谱，揭示了亚洲特异性变异在紫外线损伤修复(uvrB)和全球DNA完整性(SP_1247)基因中的作用，这些基因可能对细菌在紫外线暴露的眼表生存至关重要。通过将ermB驱动的大环内酯耐药、zmpC缺失以及独特的血清型和重组分布与这些紫外线适应特征相联系，本研究将眼部肺炎链球菌重新定义为一种独特的生态型，其区域进化特征必须纳入未来的疫苗、抗生素指南和快速分子诊断开发中，以预防致盲性眼感染。
INTRODUCTION
肺炎链球菌是机会性致病革兰氏阳性菌，可引起侵袭性肺炎球菌疾病(IPD)和非侵袭性肺炎球菌疾病(NIPD)。眼部环境的独特免疫学特征导致其临床特征和流行病学模式与其他肺炎链球菌感染不同。目前针对眼部感染肺炎链球菌的研究较为稀疏，基因组分子流行病学研究仅在美国开展，显示不可分型(NT)肺炎链球菌占眼感染的60%以上。
MATERIALS AND METHODS
肺炎链球菌分离与鉴定
从浙江三家三甲医院2010-2023年收集11株肺炎链球菌分离株，标本包括8份眼拭子和3份分泌物。通过奥普托欣敏感性、胆汁溶菌试验和lytA PCR进行鉴定。
临床数据收集
回顾性收集患者性别、年龄和主要诊断等临床数据。
肺炎链球菌血清分型
采用乳胶凝集试验和Quellung反应进行血清分型，并通过SeroBA软件进行全基因组序列分析验证。
抗菌药物敏感性试验
采用肉汤微量稀释法测定青霉素(PEN)、头孢曲松(CRO)、红霉素(ERY)、四环素(TET)和左氧氟沙星(LVX)的最低抑菌浓度(MIC)。
全基因组测序与分析
使用Illumina HiSeq X 10平台进行测序，通过Fastp进行质控，Shovill进行组装。使用MLST确定序列型(ST)，通过ABRicate筛选毒力和耐药基因，利用PopPUNK构建系统发育树，Snippy进行SNP分析，Gubbins识别重组事件。
RESULTS
眼部肺炎链球菌感染的临床特征
11例肺炎链球菌眼感染中女性3例，仅1例为5岁以下儿童。临床主要表现为角膜炎(7例)，其次为结膜炎(2例)、眼内炎(1例)和泪囊炎(1例)。大多数患者预后良好，眼内炎治疗时间最长(90天)。
肺炎链球菌血清型分布和抗菌药物敏感性
11株分离株共鉴定出9种血清型，PCV13覆盖54.5%的分离株，未发现PCV20新增血清型。基于非脑膜炎折点，1株(qz22021)对PEN(MIC=8μg/mL)和CRO(MIC=4μg/mL)耐药。除1株(qz10017)外，所有菌株对ERY(MIC≥64μg/mL)和TET耐药，对LVX(MIC=1μg/mL)均敏感。
全球眼部感染肺炎链球菌分离株的系统发育分析
鉴定出四个主要克隆复合体(CC)：CC344、CC448、CC271和CC90。中国分离株未落入这四个主要克隆中，仅2株源自主要克隆CC271。中国菌株主要呈现散发性分布，血清型和ST均不集中。
抗菌药物耐药性和毒力基因检测
PBP1a-2b-2x型86-82-162是所有分析菌株中的主要类型。中国分离株大多不携带mefA，但均编码ermB和tetM，这与美国、加拿大等国家的菌株不同。毒力因子测定结果显示四个主要克隆存在克隆特异性模式，中国大多数分离株不携带rrgABC、srtBCD或zmpC基因。
眼部感染相关肺炎链球菌的全球重组分析
中国眼部肺炎链球菌菌株的总SNP数、重组区域内SNP数和重组块数显著高于北美和欧洲菌株。中国菌株中r/m>1(重组引入SNP与突变引入SNP比值)的菌株比例与其他地区无显著差异。
眼部感染相关肺炎链球菌的全球SNP分析
SP_1247是全球所有眼部收集菌株中多态性最高的基因位点，每个菌株积累333-407个SNP。中国分离株中uvrB和SP_0338位列前五位突变基因，而北美和欧洲菌株前20位突变基因中不包含这两个基因。SP_0665和relA仅在中国眼部分离株中检测到。
DISCUSSION
PCV7/PCV13接种显著降低了2岁以下儿童肺炎链球菌结膜炎发病率。本研究中超过一半的眼部分离株属于PCV13覆盖血清型。中国分离株(携带ermB)与美国和加拿大分离株(携带mefA)的耐药基因谱差异反映了所有类型感染中肺炎链球菌大环内酯耐药谱的地区差异。
不可分型菌株是结膜炎的主要肺炎链球菌，但本研究结膜炎病例中未发现NT菌株。虽然所有角膜炎肺炎链球菌分离株均检测到ply基因，但1株缺乏nanB，且均不编码zmpC。观察到的区域特异性毒力因子编码模式表明，某些遗传谱系可能已进化出特异性状以增强致病能力。
系统发育分析鉴定出四个主要CC，提示这些克隆分布广泛，并可能具有特定特征使其在特定区域成为优势菌株。中国菌株的散发性分布和高遗传多样性表明其具有复杂的进化史和适应变异潜力。
中国菌株中独特的重组区域明显不同于其他全球区域分离株。中国菌株显著更高的SNP数得到重组区域内SNP数和重组块数增加的证实。这些差异可能归因于地理或宿主特异性影响。
生物信息学分析显示，SP_1247基因在全球每个眼部收集菌株中积累最高数量的SNP，该基因编码染色体分离蛋白SMC。uvrB在肺炎链球菌中高度保守，UvrAB复合物用于搜索和识别紫外线损伤DNA。SP_0338编码推定Clp蛋白酶的ATP结合亚基，可降解错误折叠和氧化损伤蛋白。SP_1247(DNA完整性)、uvrB(DNA损伤修复)和SP_0338(蛋白质稳态)的协同靶向定义了一个候选基因组特征，其适应性价值有待实验验证。
ACKNOWLEDGEMENTS
本研究得到浙江省自然科学基金(LY24H190003)等多个项目支持。
