·ATP增强型PB@MIL-100(Fe)纳米酶可实现双模式比率色度法及基于智能手机的水凝胶检测，用于食品样品中亚硝酸盐的检测

《Analytica Chimica Acta》：·ATP-Enhanced PB@MIL-100(Fe) Nanozyme Enables Dual-Mode Ratiometric Colorimetric and Smartphone-Based Hydrogel Detection of Nitrite in Food Samples

亚硝酸盐检测中开发了一种基于PB@MIL-100(Fe)@ATP的复合纳米酶双模式检测平台，通过比色法（652/450 nm吸光度比）和智能手机辅助成像实现高灵敏度（0.17 μM）快速检测，成功应用于真实食品样本（泡菜、腌菜、香肠），为便携式食品安全监测提供新方案。

　　

作者：戴碧瑶、董全勇、郝泰奇、张生辉、徐东、熊颖、王莉、文倩、黄志梅、任家丽

单位：中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南省稻米及其副产品深加工国家工程实验室，湖南省特种医用加工食品重点实验室，湖南省林业可食用资源安全与加工重点实验室，长沙410004，中国

摘要

背景

亚硝酸盐残留对食品安全构成重大威胁，因为过量摄入可能对人类健康造成严重风险。传统的检测技术如Griess试剂和色谱法能够成功量化亚硝酸盐含量，但这些方法通常存在样品制备复杂、选择性差、仪器昂贵、需要专业操作人员以及耗时程序等问题。这些限制阻碍了它们在即时检测（POCT）中的应用。因此，开发灵敏且便携的亚硝酸盐检测方法对于食品安全监测至关重要。

结果

我们开发了一种基于复合纳米酶PB@MIL-100(Fe)@ATP的新型双模式传感平台，用于灵敏、选择性和便携性的亚硝酸盐检测。该平台结合了普鲁士蓝（Prussian Blue）与MIL-100(Fe)金属有机框架，并利用三磷酸腺苷（ATP）作为增强剂。所得的PB@MIL-100(Fe)@ATP表现出优异的过氧化物酶类似（POD类似）催化活性，可催化3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）氧化生成蓝色的氧化TMB（TMBox），其在652 nm处具有特征吸收峰。在亚硝酸盐存在下，TMBox在酸性条件下发生重氮化反应，生成黄色的重氮化TMB，在450 nm处吸光度增加而在652 nm处吸光度降低。通过652/450 nm处的吸光度比值分析，该比色法在20分钟内实现了0.17 μM的检测限。此外，还开发了一种基于智能手机的水凝胶传感方法，通过图像捕捉和颜色分析实现亚硝酸盐的即时监测，无需额外设备。

意义

ATP增强的PB@MIL-100(Fe)纳米酶在真实腌菜、酸菜和香肠样品中成功检测到了亚硝酸盐，显示出高回收率。这种双模式平台在复杂食品基质中表现出优异的选择性和高定量准确性，为现场食品安全监测提供了一种简单、快速且多功能的工具。

引言

亚硝酸盐在食品工业中作为重要的防腐剂和着色剂，特别是在肉类和鱼类产品的加工过程中，可以防止细菌生长并保持产品外观[1]。尽管它们具有有益的防腐作用，但过量摄入亚硝酸盐会对人体健康构成高风险。主要风险在于亚硝酸盐在高温烹饪条件下会转化为亚硝胺，这与癌症发病率的增加有关[2]。此外，亚硝酸盐可与血红蛋白反应生成高铁血红蛋白，降低血液的携氧能力，可能引发危及生命的疾病[3]。因此，准确监测和控制亚硝酸盐水平对食品安全和公共卫生保护至关重要。目前已有多种亚硝酸盐检测技术，包括Griess试剂法[4]、高效液相色谱法（HPLC）[5]以及电化学方法[7][8][9][10][11]。虽然这些技术可以成功检测亚硝酸盐，但它们通常存在样品制备复杂、选择性差、仪器昂贵、需要专业操作人员以及耗时程序等缺点[12][13]，限制了其在即时检测（POCT）中的应用。因此，开发快速、经济且便携的亚硝酸盐检测方法仍是食品安全分析的重点任务。 比色检测是一种有吸引力的分析策略，它利用显色反应在目标物质存在下产生可见的颜色变化[14][15][16][17]。这种方法操作简便，适用于现场亚硝酸盐监测[18]。例如，Vallejos等人开发了一种对亚硝酸根离子敏感的比色传感膜，用于加工肉类的亚硝酸盐分析[19]；Coltro等人构建了基于微流控纸的分析装置（μPADs），可在多种场景下进行亚硝酸盐的比色测定[20]。尽管取得了这些进展，大多数比色传感器的灵敏度有限，限制了其广泛应用。具有酶模拟特性的纳米材料的出现为比色传感提供了新的途径，因为这些人造酶能够高效氧化多种显色底物，生成独特的有色产物[21][22]。然而，传统的基于纳米酶的比色平台系统由于单点催化机制和底物-催化剂相互作用效率低而催化效率不足。通过设计具有多个催化中心的复合纳米酶，可以克服这些缺点，实现更优的比色检测性能[23]。 普鲁士蓝纳米颗粒（PBNPs）因其氧化还原活性强的Fe²⁺/Fe³⁺中心而受到广泛关注，这些中心为电子转移和高效的POD类似催化提供了可能[24]。然而，由于其热力学不稳定性和聚集倾向，限制了其广泛应用。金属有机框架（MOFs）通过其高度可控的孔结构和表面活性提供了理想的解决方案[25][26]。将纳米酶与MOF基质结合显著提升了催化性能和操作稳定性。MIL-100(Fe)作为典型的MOF材料，具有超高的表面积和优异的稳定性，是构建复合纳米酶的理想平台[27]。此外，先前的研究表明引入DNA、肽、氨基酸和腺苷等生物分子可以提高纳米酶的催化活性[28]。此外，三磷酸腺苷（ATP）也被证明是一种重要的增强剂，可通过与金属中心的配位作用显著提升纳米酶活性[29][30][31]。 基于以上考虑，我们通过将普鲁士蓝与MIL-100(Fe)结合，并利用三磷酸腺苷的协同效应，制备了新型复合纳米酶PB@MIL-100(Fe)@ATP。含有氧化还原活性Fe²⁺/Fe³⁺中心的PB纳米颗粒核心表现出高效的POD类似催化活性。MIL-100(Fe)框架提供了优异的结构支持和高的表面积以及稳定性，而ATP的协调作用通过提高底物可及性和促进电子转移显著提升了催化效率。基于PB@MIL-100(Fe)@ATP的POD类似催化活性，我们设计了有效的双模式亚硝酸盐检测策略。如图1所示，该复合纳米酶的POD类似活性可催化3,3',5,5'-四甲基联苯胺氧化生成蓝色的TMBox，在过氧化氢（H₂O₂）存在下在652 nm处具有特征吸收峰。加入亚硝酸盐后，TMBox在酸性条件下发生重氮化反应，生成黄色的重氮化TMB，在450 nm处吸光度增加。这一过程导致652 nm处的吸光度降低而450 nm处的吸光度增加，溶液颜色从蓝色变为黄色。这些光谱和视觉变化为亚硝酸盐的比色检测提供了依据。此外，我们还开发了一种基于智能手机的水凝胶传感方法，用于便携式亚硝酸盐检测。水凝胶的多孔网络提供了有效的封装效果，保证了光学透明性和高负载能力，增强了纳米酶的稳定性。该基于水凝胶的系统通过纳米酶催化的比色反应实现即时亚硝酸盐检测。通过智能手机拍照并通过应用程序分析色调值，我们提供了一种快速、灵敏且无需设备的亚硝酸盐检测方法。鉴于快速可靠的亚硝酸盐监测在食品安全中的关键重要性，基于PB@MIL-100(Fe)@ATP的双模式平台为设计高性能复合纳米酶提供了新范式，并扩展了它们在现场食品安全分析和医疗监测中的应用。

POD类似催化活性和动力学研究

使用TMB作为显色底物，在H₂O₂存在下评估了PB@MIL-100(Fe)的POD类似活性。简要来说，将20 μL的PB@MIL-100(Fe)（0.5 mg/mL）加入到含有750 μL HAc-NaAc缓冲液（0.2 M，pH 3.5）和20 μL TMB（10 mM）的反应混合物中。加入100 μL的H₂O₂（100 mM）后，混合物在37°C下孵育15分钟，使用紫外-可见分光光度计监测652 nm处的吸光度值。

PB@MIL-100(Fe)的表征

为了验证合成材料的成功形成，分别对MIL-100(Fe)和PB@MIL-100(Fe)进行了扫描电子显微镜（SEM）成像，如图1A和图1B所示。PB@MIL-100(Fe)显示出类似爆米花的三维颗粒，其表面比MIL-100(Fe)更粗糙，表明普鲁士蓝纳米颗粒已成功涂覆在MIL-100(Fe)上。

结论

在本研究中，我们成功开发了一种用于亚硝酸盐检测的新型复合纳米酶PB@MIL-100(Fe)@ATP。首先在MIL-100(Fe)框架表面原位形成了普鲁士蓝纳米颗粒，随后通过ATP修饰显著提升了其催化性能。基于亚硝酸盐与TMBox之间的重氮化反应，我们进一步建立了基于比色分析的双模式传感平台。

CRediT作者贡献声明

黄志梅：撰写 – 审稿与编辑、方法学、形式分析。 任家丽：撰写 – 审稿与编辑、方法学、形式分析。 文倩：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、验证、方法学、数据管理、概念化。 戴碧瑶：撰写 – 初稿撰写、数据管理。 董全勇：验证、数据管理。 郝泰奇：验证、数据管理。 张生辉：验证、数据管理。 徐东：方法学、形式分析。 熊颖：

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

竞争利益声明

作者声明没有已知的可能影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了湖南省重点研发项目（2024JK2159）和湖南省教育厅重点科研计划（23A0207）、国家自然科学基金（U24A20466）、湖南省重点研发项目（2024JK2158）以及湖南省科技创新平台与人才计划（2019TP1029）的财政支持。