《mSystems》：Taurine attenuates Listeria monocytogenes-induced inflammation and pyroptosis in mouse model by regulating MAPK and NLRP3/caspase-1/GSDMD pathways
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本研究揭示了膳食氨基酸牛磺酸对单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes, Lm)感染的双重保护机制：直接抑制细菌生长/毒力（溶血活性、生物膜形成），并通过调节MAPK信号通路（增强T细胞免疫）和NLRP3/caspase-1/GSDMD通路（抑制细胞焦亡）缓解宿主过度炎症反应。该发现为应对抗生素耐药性危机提供了具有即刻转化潜力的非抗生素治疗新策略。
Taurine inhibits Lmgrowth, hemolytic activity, and biofilm formation
牛磺酸，一种含硫游离氨基酸，其化学结构包含连接在氨基酸β-碳上的磺酸基。研究首先通过肉汤微量稀释法确定了牛磺酸对单核细胞增生李斯特菌(Lm)的最低抑菌浓度(MIC)为100 mM，但即使在最高测试浓度(1600 mM)下也未能表现出杀菌活性，其最低杀菌浓度(MBC)高于此值，MBC/MIC比值>16，明确将牛磺酸归类为针对Lm的抑菌剂。生长曲线和菌落形成单位(CFU)测定显示，牛磺酸以浓度依赖的方式抑制Lm生长。在800 mM浓度下，牛磺酸使生长平台期延迟2小时，并使CFU较对照组减少50%。重要的是，包含800 mM甘露醇的等渗对照显示出与800 mM牛磺酸不同的生长曲线，证实观察到的抑制是特定的生物学效应，而非渗透压影响。此外，牛磺酸显著降低了Lm的毒力。经细菌密度标准化后的特异性溶血活性在800 mM牛磺酸处理下降低了近一半，此效果显著大于等渗对照，表明存在超越渗透压的特异性生物学抑制。同时，800 mM牛磺酸使生物膜形成减少了24%。这些结果表明牛磺酸能够抑制细菌复制并削弱重要的致病过程。
转录组测序分析揭示了牛磺酸处理显著改变了Lm的基因表达谱，共有552个基因上调，495个基因下调。基因本体论(GO)富集分析显示，差异表达基因(DEGs)在生物过程类别中主要与蛋白质代谢过程、酰胺代谢过程和肽代谢过程相关；在细胞组分类别中，GO功能组件以核糖体等细胞内组分为主；在分子功能类别中，DEGs主要与各种类型的核苷酸结合相关。京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析强调了这些DEGs在代谢通路中的显著参与，特别突出了它们在核糖体、氨酰-tRNA生物合成、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成中的作用。功能富集分析揭示，涉及的基因主要与核糖体生物发生和氨基酸代谢相关。通过qRT-PCR对涉及毒力(inlA和inlB)和中心代谢(dhal_1, budA, alsS, cysk)的六个候选基因表达模式的实验验证，证实了它们在牛磺酸处理组中的显著下调。这意味着牛磺酸可能通过破坏必需代谢过程来抑制Lm生长。
Taurine can effectively alleviate Lm-mediated cytotoxicity and pyroptosis in J774.1 macrophages
为探索牛磺酸在Lm感染中的作用，研究检测了牛磺酸处理下J774.1巨噬细胞内细菌的生长情况。先前的细胞毒性评估确保了牛磺酸对J774.1细胞的无毒性质，因此选择100 mM浓度用于后续研究。在感染前用牛磺酸(100 mM)处理，使J774.1巨噬细胞内Lm的存活率显著降低了79%，并使乳酸脱氢酶(LDH)释放减少了12.4%。这表明牛磺酸可以保护细胞免受细菌侵袭和细胞毒性。此外，牛磺酸抑制了Lm触发的IL-1β、IL-6、TNF-α和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达的增加，并使细胞凋亡减少了14.56%。为阐明潜在机制，研究调查了细胞焦亡的关键介质——NLRP3炎症小体通路。蛋白质印迹分析证实，牛磺酸显著抑制了Lm诱导的NLRP3炎症小体和IL-1β的激活。使用NLRP3特异性抑制剂MCC950进行的挽救实验表明，当NLRP3被MCC950药理抑制时，牛磺酸降低IL-1β、caspase-1和GSDMD N末端片段水平以及减弱细胞死亡的能力被消除。这些发现表明，牛磺酸治疗可通过特异性抑制NLRP3炎症小体通路，有效限制Lm在宿主细胞内的复制，并防止Lm诱导的细胞损伤。
Taurine improves survival and reduces bacterial burden in mice
为检验牛磺酸对Lm感染小鼠的治疗效果，BALB/c小鼠经静脉注射2 × 104CFU的Lm，然后以100至800 mg/kg的剂量给予牛磺酸。结果显示，牛磺酸以剂量依赖的方式显著提高了存活率。400 mg/kg的剂量导致100%存活，而对照组在感染后第9天全部死亡。在整个实验期间监测小鼠体重，结果显示400和800 mg/kg剂量的牛磺酸治疗组从第2天开始经历轻微的体重减轻，因此选择400 mg/kg作为后续实验的最佳剂量。此外，400 mg/kg剂量的牛磺酸治疗显著减少了关键器官中的细菌定植。特别是，与感染对照组相比，肝脏中的CFU减少了59倍，脾脏减少了6.8倍，大脑减少了20倍。
Taurine exhibits favorable pharmacokinetics with high accumulation in major target organs
为提供牛磺酸体内保护作用的药代动力学基础，研究测量了单次腹腔注射400 mg/kg剂量后牛磺酸在血清、肝脏和脾脏中的浓度。牛磺酸被迅速吸收到血液中，在给药后0.5小时达到最大浓度(Cmax)6.6 mM，此后血清浓度迅速下降。值得注意的是，牛磺酸在肝脏和脾脏中表现出广泛的组织分布和显著的滞留。药物迅速在这些靶器官中积累，脾脏在0.5小时达到惊人的Cmax180 mM。同时，肝脏也显示出强大的摄取，在稍晚的达峰时间(Tmax)1小时达到Cmax53.3 mM。在整个实验期间，两个器官中的牛磺酸浓度都远高于血清中的浓度。值得注意的是，脾脏显示出最持久的药物暴露，在长达48小时内形成高于140 mM的 prolonged plateau，而肝脏也维持显著升高的水平。这些结果表明，给予的牛磺酸能有效靶向并积累在感染的关键器官中，并在较长时间内达到并维持较高的局部浓度。
Taurine effectively attenuates Lmpathogenicity in vivo
为进一步评估牛磺酸对Lm感染的保护作用，评估了氧化应激和组织损伤的关键标志物——肝脏、脾脏和大脑中的髓过氧化物酶(MPO)和过氧化氢(H2O2)水平。牛磺酸通过降低MPO活性和H2O2水平，有效抑制了Lm诱导的氧化应激。组织病理学评估进一步证明了牛磺酸的保护作用。感染Lm的小鼠表现出严重的肝坏死和脾脏生发中心破坏，这些症状经牛磺酸治疗后得到显著改善。此外，牛磺酸改善了血脑屏障的完整性，Evans Blue渗漏显著减少。总之，牛磺酸对Lm感染具有保护作用，有效抑制了重要器官中的细菌负荷，从而显示出其巨大的治疗潜力。当宿主面临感染威胁时，炎症过程被触发。与氧化应激和病理分析一致，Lm感染显著提高了肝脏和脾脏组织中IL-1β、IL-6、TNF-α和iNOS的水平。这些发现表明，牛磺酸通过两种关键机制发挥其对Lm感染的治疗作用：直接抑制细菌生长和解决宿主炎症反应。
Taurine enhances T-cell immune responses against Lminfection
为研究牛磺酸的免疫调节作用，检测了Lm感染小鼠的脾T细胞反应。经牛磺酸治疗的小鼠显示出从Lm诱导的脾细胞耗竭中显著恢复，总脾细胞数量比未治疗的感染小鼠增加了2.5倍。流式细胞术分析显示，牛磺酸有效逆转了感染驱动的T细胞数量减少，将其绝对数量从每脾1.2 × 106个增加到3.8 × 106个。尽管Lm感染组和牛磺酸治疗组之间脾脏CD4+和CD8+T细胞的百分比没有差异，但牛磺酸治疗组中CD4+和CD8+T细胞的绝对数量基本恢复到正常水平。还检测了T细胞内IFN-γ的表达。两个感染组与对照组相比，CD4+细胞群中IFN-γ+细胞的百分比显著降低。牛磺酸治疗组中IFN-γ+CD4+细胞的总数略有变化，但未观察到显著差异。此外，牛磺酸治疗组中CD8+细胞群中IFN-γ+细胞的百分比，包括IFN-γ+CD8+细胞的绝对数量，均显著高于Lm单独感染组。
Taurine enhances MAPK signaling pathway and downregulates Lm-activated NLRP3 inflammasome in mice
牛磺酸治疗对肝脏中与Lm感染相关的关键信号通路产生了双重调节作用。蛋白质印迹分析显示，牛磺酸引发了MAPK通路(p38/JNK/ERK磷酸化增加)的级联激活，同时抑制了NLRP3炎症小体的组装(NLRP3蛋白、cleaved caspase-1和GSDMD N末端片段表达减少)。为确立p38 MAPK激活的功能重要性，研究在体内使用了抑制剂SB203580。p38的药理抑制显著减弱了牛磺酸的治疗效果，表现为存活率降低、肝脏和脾脏中细菌清除能力受损以及脾脏CD4和CD8+T细胞恢复受到抑制，表明p38 MAPK激活对牛磺酸的疗效至关重要。免疫荧光染色也提供了直接视觉证据，表明牛磺酸显著减少了ASC speck的形成及其与caspase-1的共定位，表明NLRP3炎症小体激活受到抑制。这种调节模式具有重要的功能意义。TUNEL染色的定量分析证实，牛磺酸干预使Lm诱导的肝细胞焦亡率降低了约19%。免疫荧光检测显示，肝组织中CD4+和CD8+T细胞的浸润分别增加了2.4倍和3.1倍。上述结果揭示了牛磺酸的多重调节机制，包括激活MAPK依赖的细胞存活信号轴、阻断NLRP3介导的焦亡执行程序以及重塑抗菌免疫微环境以增强T细胞反应。
讨论
Lm是一种革兰氏阳性、兼性厌氧细胞内寄生菌，是引起人类李斯特菌病的重要机会性病原体，也是公共卫生关注的最重要的食源性病原体。由于其在环境中的持久性和高发病率、死亡率的相关性，Lm备受关注。当前人类Lm感染的治疗策略主要依赖抗生素，其通过破坏细胞壁完整性、蛋白质合成和其他生命过程来靶向细菌的生存和复制。然而，随着抗生素的广泛和过度使用，细菌耐药性和严重副作用日益普遍，凸显了对Lm感染非抗生素治疗的迫切需求。膳食干预或天然食物来源的化合物已成为管理健康问题的安全且有前景的替代方案。牛磺酸是人体内丰富的必需氨基酸，是一种具有多种生理和药理活性的天然产物。它最初从牛胆汁中分离出来，因此得名。在过去的三十年里，关于牛磺酸在代谢综合征中作用的研究稳步增长，建立了坚实的研究框架。然而，关于其在感染性疾病中的研究直到近年才成为焦点。鉴于其已确立的安全性和低毒性，牛磺酸代表了一个可行的治疗候选物。本研究证明牛磺酸显著减轻了Lm诱导的小鼠组织氧化应激和炎症，其潜在机制可能是通过抑制NLRP3通路。此外，牛磺酸激活了MAPK通路，逆转了Lm介导的淋巴细胞耗竭，并增加了活化的CD8+T细胞，表明其在T细胞激活中起着关键作用。
细菌培养实验确实证实牛磺酸能有效抑制Lm生长。此外，这种抑制效应被确定为特异性的，因为它显著大于等渗甘露醇对照引起的影响，从而排除了渗透压作为混杂因素，并提示涉及更具体的机制。通过转录组分析，发现牛磺酸可以下调代谢相关基因的表达，从而抑制Lm的生长和生物膜形成。李斯特菌溶胞素O(LLO)是细菌分泌的一种成孔蛋白，是Lm生存和感染不可或缺的分子武器。LLO的存在是Lm致病性的标志，也是开发新型抗菌策略的重要靶点。反映LLO水平的溶血测定结果表明，牛磺酸显著抑制了溶血活性，提示其在减弱Lm致病性方面的潜在作用。与此一致的是，原核毒力基因hlyA(编码LLO)的qPCR结果进一步证实了这些发现。LLO产生活性氧(ROS)，影响钾(K+)和钙(Ca2+)离子流，并损害线粒体完整性，所有这些最终导致NLRP3炎症小体的组装和激活，进而激活caspase-1，促进促炎细胞因子如IL-1β和IL-18的成熟和释放，最终引发剧烈的炎症反应。据报道，在缺乏LLO的L. monocytogenes突变体中，IL-1β的产生和NLRP3炎症小体的激活受损。与这些发现一致的是，能够有效抑制毒素产生的牛磺酸，有能力减少NLRP3和caspase-1的激活，导致促炎细胞因子IL-1β的减少。重要的是，牛磺酸和MCC950的组合使用并未产生比单独使用任一处理更强的抑制焦亡的叠加或协同效应。这一观察结果 strongly suggests 牛磺酸和MCC950在相同的分子通路中起作用，并且 specifically，牛磺酸主要通过抑制NLRP3炎症小体来发挥其抗焦亡作用。
本研究的一个关键发现是牛磺酸具有良好的药代动力学特征，这为其在Lm感染中的有效性提供了令人信服的解释。尽管体外直接抗菌作用所需的100 mM浓度较高，但我们的PK数据令人信服地表明，400 mg/kg的剂量可以在整个感染关键期间在靶器官脾脏和肝脏中达到并维持毫摩尔水平的牛磺酸浓度。这种显著的组织特异性确保了牛磺酸被精确递送到Lm感染的"前线"。
Lm感染可诱导细胞凋亡，这取决于多种因素，包括细菌接种量、感染持续时间、涉及的宿主细胞类型以及宿主免疫状态。淋巴细胞凋亡是小鼠早期Lm感染(通常1-3天)的一个公认后果，并在感染后24小时以剂量依赖的方式发生，LLO介导了这一过程。牛磺酸的抗凋亡作用已在多项研究中被描述。牛磺酸治疗通过激活AKT通路、增加Bax和Bcl-2蛋白水平以及减弱半胱天冬酶3和caspase-9的mRNA表达，改善了糖尿病肾病中的细胞凋亡。类似地，牛磺酸通过NGF-Akt/Bad通路抑制海马神经元凋亡，并调节线粒体介导的凋亡以减轻黄曲霉毒素诱导的肝损伤。我们的体外实验确实证实了早期凋亡的出现，并且牛磺酸可以逆转这一过程，确立了其在Lm感染早期阶段引发的细胞死亡中的保护能力。然而，随着感染的进展和免疫系统的日益激活，细胞焦亡往往变得更加明显。Lm感染模型中的细胞因子风暴数据与报道的焦亡相关炎症因子释放模式一致。这种相关性与动脉粥样硬化模型中观察到的炎症放大机制相匹配。越来越多的证据表明牛磺酸对焦亡具有有益作用。研究表明，牛磺酸可以通过抑制NLRP3激活和随后的焦亡来缓解和预防血吸虫病相关肝纤维化的发生。它还可以减轻As2O3诱导的NASH中的NLRP3炎症小体级联和焦亡。与这些结果相似，我们的动物研究证明了Lm感染应答中小鼠肝脏中发生了焦亡，并且这些效应可以通过牛磺酸给药来逆转。综上所述，这些发现表明牛磺酸的抗菌作用可能涉及焦亡调节。
研究表明，IBD患者血清牛磺酸水平显著降低，且牛磺酸水平与疾病活动度呈负相关。在其他感染相关研究中，牛磺酸显示出相应的抗氧化和抗炎作用。牛磺酸在Streptococcus uberis诱导的小鼠乳腺炎中抑制了NADPH氧化酶活性，并抑制了MAPK信号通路的激活，这减轻了患乳腺炎小鼠的氧化应激水平和炎症，并起到了治疗作用。在Escherichia coli和Staphylococcus aureus感染的体外实验中，牛磺酸预处理在一定程度上抑制了TLR2和TLR4的上调以及ROS的产生，并降低了细胞中iNOS的水平，从而在细菌感染期间调节炎症反应，并通过提高细胞的抗氧化能力来防止细胞损伤。先天免疫不仅对抵御入侵病原体的初始防御至关重要，适应性免疫也发挥着关键作用，特别是在实现Lm的完全清除方面。在适应性免疫应答中，CD4+T细胞和CD8+T细胞产生IFN-γ，激活巨噬细胞，增强其杀菌活性。先天免疫和适应性免疫相互补充，共同作用以清除病原菌。我们发现，通过流式细胞术检测T细胞和IFN-γ的分泌，牛磺酸治疗有效恢复了感染Lm小鼠脾淋巴细胞数量的减少。牛磺酸的干预显著提高了脾脏细胞总数和脾脏T细胞总数，尤其是分泌IFN-γ的CD8+T细胞。本研究中观察到的CD8+T细胞协同效应和促炎因子减少与先前的研究一致。牛磺酸对TLR信号转导的潜在抑制和免疫调节可能有助于在各种病理条件下恢复免疫稳态。
MAPK通路在细胞增殖中的作用已在生物学和医学领域得到广泛认可。MAPK家族包括几个成员，如ERK、JNK和p38激酶，它们都参与细胞对外部信号的响应。当细胞接收到增殖信号，例如来自生长因子的信号时，该信号会激活位于细胞膜上的受体酪氨酸激酶。随后发生一系列信号事件，最终导致MAPKs的激活。激活的MAPKs进入细胞核，在那里它们可以磷酸化并激活多个转录因子，进而影响基因表达，促进细胞周期进程和细胞增殖。我们的研究发现牛磺酸通过MAPK通路促进淋巴细胞增殖。这种机制类似于其在男性生殖中促进生精细胞增殖的作用。这些发现表明牛磺酸通过保守的MAPK信号通路协调多个生理系统中的细胞增殖。我们的体内抑制剂研究进一步巩固了这一机制，证明用SB203580药理阻断p38 MAPK有效逆转了牛磺酸带来的益处，包括存活率、细菌清除和T细胞恢复。这一关键发现确立了p38 MAPK激活在介导牛磺酸治疗效果中的因果作用。虽然MAPK通路通常与促炎反应相关，但它在免疫细胞增殖和存活中的作用同样关键。在我们的研究中，MAPK激活与改善结局相关的看似矛盾的现象可以通过其在促进淋巴细胞扩增和适应性方面的基本功能来解释。MAPK激活在促进CD8+T细胞扩增中的关键作用(这对有效清除病原体至关重要)已在其他感染模型中得到阐明，从而为我们观察到的牛磺酸治疗后T细胞反应增强提供了机制基础。在引发广泛淋巴细胞凋亡的严重细菌感染背景下，牛磺酸激活MAPK信号的能力可能为T细胞提供必要的促生存和促增殖信号，从而对抗Lm诱导的淋巴细胞减少并恢复适应性免疫。
作为范式模型生物，L. monocytogenes具有复杂的致病机制。因此，我们的研究同时针对细菌的毒力和代谢，并增强宿主的免疫防御以对抗入侵者，从而达到治疗效果。本研究的一个关键
