《Aquaculture》：Revealing the molecular mechanisms for superior quantitative traits in a novel sea cucumber strain by DNA methylation sequencing
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DNA甲基化调控海参与环境胁迫互作的分子机制及育种应用研究，通过全基因组bisulfite测序比较快速生长株（WP）与正常株（CK）的甲基化差异，发现CHH高甲基化区域显著富集与能量代谢、神经信号通路相关的基因，且甲基化水平变化影响宿主能量利用与抗逆能力，为海参与环境胁迫互作机制及分子育种提供新依据。
Zelong Zhao|Hongjuan Sun|Wei Zhao|Yongjia Pan|Liang Zhao|Guohan Zhang|Ying Dong|Xiaoyan Guan|Shan Gao|Bai Wang|Jingwei Jiang|Zunchun Zhou
农业农村部水生种质资源保护与利用重点实验室；辽宁省海洋与渔业科学研究院海洋水生动物种质改良与优质种子培育重点实验室；中国辽宁省大连市116023
摘要
市场需求的增加对海参Apostichopus japonicus的育种效率提出了更高的要求。了解不同A. japonicus品种在数量性状和环境胁迫抗性方面的分子机制变化，可以为未来的海参选择性育种提供理论支持。DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰，它在许多生物过程中调节基因表达。本研究对一种具有快速增重特性（WP）的新品系A. japonicus和正常品系（CK）进行了全基因组亚硫酸盐测序（WGBS）。通过对差异甲基化区域相关蛋白编码基因的GO和KEGG富集分析，发现核酸结合、神经信号转导、转录和翻译调控以及能量利用等方面受到DNA甲基化的显著影响。在WP品系中，某些神经信号通路可能因DNA甲基化水平的变化而激活，从而影响其肌肉发育和运动能力。此外，WP品系的快速生长可能与DNA甲基化调控的增强自噬作用有关，这种作用可以为宿主产生更多的能量和必需的生物分子。此外，通过DNA甲基化调控的代谢效率变化可能是WP品系抵抗高温和低盐度条件的机制。WGBS分析为这种新型A. japonicus品系在数量性状和环境胁迫抗性方面的关键基因调控提供了重要信息。
引言
海参Apostichopus japonicus是一种主要分布在日本、俄罗斯、韩国和中国沿海地区的棘皮动物（Zhan等人，2019年）。由于其营养价值和药用价值，这种物种已被中国祖先用作食物超过一千年（Xia和Wang，2015年）。随着巨大的市场需求，A. japonicus的养殖在中国迅速发展，2024年的年产量已超过32万吨（渔业局，2025年）。A. japonicus主要在户外池塘中养殖，因此经常遭受各种环境胁迫。异常的环境条件对A. japonicus的水产养殖业造成严重影响，并导致巨大的经济损失。由于全球变暖的影响，夏季A. japonicus养殖池塘的水温经常超过30°C（Jiang等人，2017年）。如此高的温度超出了A. japonicus的耐受范围，导致大量死亡（Liu等人，2014年）。在养殖池塘中，暴雨导致的低盐度也会大大增加A. japonicus疾病的发病率（Zhang等人，2017年）。因此，通过选择性育种获得能够抵抗高温和低盐度的A. japonicus品种是提高A. japonicus养殖效率的最佳方法之一。
基因表达的变化是A. japonicus抵抗环境胁迫的主要机制之一。许多研究分析了A. japonicus在mRNA水平上对环境压力的响应。例如，转录表达分析显示A. japonicus中的酚氧化酶能快速响应低盐度、缺氧和温度变化（Jiang等人，2020年）。此外，在高温条件下观察到A. japonicus中有1153个基因表达差异，其中46个基因参与免疫反应（Li等人，2019年）。在A. japonicus中，基因表达受到协同过程的调控，而DNA甲基化是转录水平上的一个关键步骤（Sun等人，2020年）。研究表明，DNA甲基化通过调节基因表达参与多种生物过程，包括胚胎发育、病原体感染、疾病防御或肿瘤发生（Smith和Meissner，2013年）。因此，不可否认A. japonicus对环境胁迫的耐受性差异可能源于DNA甲基化介导的基因表达变化。
在A. japonicus的选择和育种过程中，我们获得了一个新的品系，称为WP品系，其生长速度比正常A. japonicus品系更快。为了探讨这个新品系是否也具有抵抗环境胁迫的能力，我们对它进行了胁迫刺激实验。通过全基因组亚硫酸盐测序（WGBS）来分析海参体壁中的DNA甲基化水平差异。我们希望通过比较这两个群体在正常条件下的表现，探索WP品系快速生长的潜在机制。此外，我们还希望研究WP品系是否具有抵抗环境胁迫的潜力。本研究的结果对于推广这种新品系的大规模养殖具有重要意义，并为未来的海参选择性育种提供理论支持。
实验动物
从辽宁海洋与渔业科学研究院育种中心获得了体重为150±20.1克的成年A. japonicus常规非选择性品系（标记为CK）和新品系（标记为WP）。这些海参在使用前在实验室中适应了一周。用于临时培养的海水经过沙子和300微米尼龙筛子的过滤。海水养殖池的条件维持在24°C，盐度为
WGBS测序和DNA甲基化图谱分析
对WP和CK样本进行了WGBS测序，以研究新品系的DNA甲基化情况。亚硫酸盐转化后，对18个DNA文库进行了测序，共获得4,875,791,602个高质量读段，每个样本的读段范围为217,840,902至339,047,356个。唯一映射的读段平均覆盖了A. japonicus基因组的46.19%，重复率为16.78%-55.42%，亚硫酸盐转化效率超过99%（表1）。我们观察到
讨论
最近关于真核生物DNA甲基化的广泛研究表明，甲基胞嘧啶在基因表达、表观遗传记忆维持、发育和胁迫抗性中起着重要作用（Mandaviya等人，2014年）。在这里，我们利用WGBS技术报告了两种A. japonicus品系的DNA甲基化差异。我们的发现表明，甲基化位点广泛分布在A. japonicus基因组中，而基因编码序列是这些位点的主要所在区域
结论
本研究应用WGBS测序技术研究了两种A. japonicus品系（WP和CK）在不同环境条件下的DNA甲基化情况。我们发现CHH是最主要的甲基化胞嘧啶类型，甲基化位点主要位于基因体上。在不同环境条件下对不同品系的甲基化谱进行成对比较，得到了许多差异甲基化区域（DMRs）。对照组和实验组中高甲基化和低甲基化DMRs的数量相对相等
CRediT作者贡献声明
Zelong Zhao：撰写——原始草案，可视化，方法学，正式分析，概念化。Hongjuan Sun：方法学，正式分析，数据管理。Wei Zhao：可视化，方法学，正式分析。Yongjia Pan：验证，软件。Liang Zhao：资源，调查。Guohan Zhang：资源。Ying Dong：项目管理，资金获取。Xiaoyan Guan：软件，资源。Shan Gao：资源。Bai Wang：资源。Jingwei Jiang：撰写——审稿与编辑，
利益冲突声明
所有作者均声明不存在利益冲突，并同意发表本文。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（编号U24A200104）、辽宁振兴人才计划（编号XLYC2203191）、辽宁省科技项目（编号2023JH1/10200007，2025-MS-317）、大连市科技人才创新支持计划（编号2023RJ007）以及辽宁省农业科学院基础研究基金（编号2025HQ1304，2025JCX1008）的支持。
