FBXL3磷酸化介导GLDC泛素化调控MHC-I表达与肿瘤免疫逃逸的机制研究

《Cell Insight》：Phosphorylation of FBXL3 mediates GLDC polyubiquitination to suppress MHC-I expression and promote cancer immune evasion

本研究针对EGFR激活肿瘤中MHC-I表达抑制导致的免疫逃逸难题，揭示了SRC磷酸化FBXL3Y306介导GLDCK636位点K63连接多聚泛素化的新机制，阐明了该修饰通过招募SMARCE1/DMAP1复合物抑制STAT1转录活性的分子通路，为联合SRC抑制剂与免疫检查点阻断疗法提供了理论依据。

　　

在肿瘤免疫治疗领域，MHC-I类分子表达下调是肿瘤细胞逃避CD8⁺T细胞监视的关键策略。虽然既往研究发现甘氨酸脱羧酶（GLDC）在多种肿瘤中异常高表达，但其在免疫调节中的作用机制尚不明确。尤其令人困惑的是，当表皮生长因子受体（EGFR）激活后，GLDC如何从代谢酶转变为核内转录调控因子，进而抑制主要组织相容性复合体I（MHC-I）基因表达的分子开关仍未破解。这一科学盲点限制了针对GLDC相关免疫逃逸途径的靶向治疗开发。

针对这一难题，武汉大学中南医院医学研究院刘锐和李树团队在《Cell Insight》发表的最新研究，系统揭示了EGFR-SRC-FBXL3信号轴调控GLDC核内泛素化修饰的精细分子机制。研究人员通过多种前沿技术方法展开探索：利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建GLDC、FBXL3、USP22等基因敲除细胞系；采用免疫共沉淀（Co-IP）与蛋白质印迹（Western blot）分析蛋白质相互作用与修饰；通过体外激酶实验验证SRC对FBXL3^Y306的直接磷酸化作用；借助染色质免疫沉淀（ChIP）和甲基化DNA免疫沉淀（MeDIP）技术解析转录调控机制；结合流式细胞术评估MHC-I表达水平；并建立小鼠移植瘤模型验证靶点治疗的免疫学效应。

2.1 核内GLDC在EGFR激活后发生K636位点泛素化

研究人员发现EGF刺激可诱导GLDC发生K63连接的多聚泛素化修饰，且该修饰严格依赖于GLDC的磷酸化（Y993/Y1008）和核定位（L998/V999）。通过截断体筛选和点突变实验，最终将泛素化位点锁定在高度保守的K636位点。功能实验表明，GLDC^K636R突变体无法逆转GLDC缺失引起的MHC-I表达上调，证实该位点泛素化对MHC-I抑制功能至关重要。

2.2 FBXL3介导GLDC的K63连接泛素化

通过196种泛素相关蛋白的筛选，研究发现FBXL3可特异性促进GLDC的K63连接泛素化。FBXL3与GLDC的相互作用需要GLDC的磷酸化和核转位，且FBXL3缺失会完全消除EGF诱导的GLDC泛素化。值得注意的是，FBXL3调控MHC-I表达的作用完全依赖于GLDC，在GLDC敲除细胞中，FBXL3缺失不再影响MHC-I水平。

2.3 USP22拮抗FBXL3介导的GLDC泛素化

质谱分析发现USP22可与GLDC特异性结合。功能实验表明USP22能去除GLDC的K63连接泛素链，且该活性依赖于其去泛素化酶功能。USP22缺失会增强GLDC泛素化并降低MHC-I表达，而这种效应在GLDC缺失细胞中消失，提示USP22通过调控GLDC泛素化状态影响MHC-I表达。

2.4 EGFR激活触发SRC介导的FBXL3^Y306磷酸化

研究发现EGF刺激可诱导FBXL3酪氨酸磷酸化，并通过位点突变筛选将磷酸化位点确定为Y306。利用特异性抗体证实SRC可直接磷酸化该位点，而SRC抑制剂saracatinib或SRC敲除均可阻断这一过程。功能上，FBXL3^Y306F突变体无法与GLDC结合，也不能促进GLDC泛素化或抑制MHC-I表达。

2.5 GLDC泛素化促进SMARCE1和DMAP1招募

机制深入研究表明，GLDC^K636泛素化是其招募SMARCE1和DMAP1的必要条件。GLDC^K636R突变体无法恢复GLDC缺失细胞中STAT1/SMARCE1与IRF1启动子的结合，也不能重建DNMT1介导的启动子甲基化水平。FBXL3缺失或FBXL3^Y306F突变均会破坏GLDC与SMARCE1/DMAP1的相互作用。

2.6 GLDC^K636泛素化抑制CD8⁺T细胞免疫监视

在免疫健全小鼠模型中，表达GLDC^K636R的肿瘤细胞生长显著受限，且肿瘤内CD8⁺T细胞浸润数量和效应功能（IFNγ和GzmB分泌）明显提升。而CD8⁺T细胞清除实验证实该抗肿瘤效应完全依赖于适应性免疫。

2.7 达沙替尼增强PD-1阻断疗效

SRC抑制剂达沙替尼单药治疗即可提升肿瘤细胞MHC-I表达，增强CD8⁺T细胞抗肿瘤功能。更重要的是，达沙替尼与抗PD-1抗体联用展现出协同抗肿瘤效果，显著延长小鼠生存期。

该研究首次描绘了EGFR-SRC-FBXL3-GLDC-MHC-I信号通路的完整调控网络，阐明了蛋白质翻译后修饰级联反应如何将细胞膜受体信号传递至核内转录调控的全新机制。特别值得注意的是，FBXL3作为 circadian clock 调控因子被发现在免疫逃逸中扮演关键角色，拓展了该蛋白的生物学功能认知。研究证实GLDC^K636位点的K63连接泛素化不具有降解功能，而是作为分子"开关"激活GLDC的转录抑制功能，这种非经典泛素化模式为泛素化研究提供了新视角。

从转化医学角度，该研究为EGFR高表达肿瘤的免疫治疗耐药提供了新的解决思路。SRC抑制剂达沙替尼与免疫检查点阻断的协同效应，提示靶向肿瘤细胞内在信号通路可有效改善肿瘤微环境免疫状态。此外，FBXL3^Y306磷酸化、GLDC^K636泛素化等特异性修饰位点的发现，为开发精准免疫治疗联合策略提供了潜在靶点。这项研究不仅深化了对肿瘤免疫逃逸机制的理解，更为克服免疫治疗耐药性开辟了新的研究方向。