限制机制增强酶内在活性的原理

《Chinese Journal of Catalysis》：Mechanism of confinement enhancing enzyme intrinsic activity

限制环境中的酶催化机制研究揭示，大分子拥挤通过优化酶活性位点预组织化和增大初态与过渡态重叠度，显著提升BSLA和PETase的固有活性，其热力学活化参数显示焓熵协同效应。

　　

曹玉飞|陈爽|梁慧|杨俊荣|娄文勇|葛俊

华南理工大学食品科学与工程学院应用生物催化实验室，中国广东省广州市510640

摘要

在生物细胞或工业应用中，酶催化作用通常发生在表面和体积受限的环境中。尽管这种现象在体内（in vivo）和体外（in vitro）都很普遍，但对于这些限制因素如何调节酶的固有活性的全面机制理解仍然较为缺乏。本文探讨了限制因素在塑造酶活性中的作用。实验表明，由大分子拥挤引起的限制作用能够增强脂肪酶的活性。为了揭示活性增强的原因，我们通过广泛的分子动力学（MD）和经验价键（EVB）模拟计算了脂肪酶催化的热力学活化参数。EVB方法被证明是一种有效的方法，它能够通过MD进行大量采样，并评估酶催化的热力学活化参数。我们的研究发现，对脂肪酶环区施加限制会导致其固有活性提高，这种效应取决于限制的程度。活化的自由能降低源于焓和熵的增加。活性位点的更好预组织以及初始状态和过渡状态之间的更大构象空间重叠增强了脂肪酶的催化作用。我们观察到，由于表面限制而产生的催化增强效应不仅限于脂肪酶，也适用于PETase，这突显了其在酶设计和工程中的潜在普遍性。

引言

酶催化是生物过程的基石，在化学转化领域具有无可比拟的优势[1, 2, 3]。酶的显著特异性、效率和可持续性长期以来一直激发了它们在各种工业过程中的应用[4, 5]。酶的催化能力从根本上源于其氨基酸序列[6]。随着基于人工智能的工具（如AlphaFold [7, 8]和RoseTTAFold [9]）的出现，基于序列的理性酶设计时代已经到来[10, 11, 12, 13, 14]。

除了酶的序列外，受限的微环境在体内实现高效生物催化中也起着关键作用[15]。在生物细胞内，表面和体积受限的酶被组织成不同的区室，并处于大分子拥挤的环境中，协调着复杂的化学反应网络。这些限制不仅影响了多种酶催化的级联反应中中间体的扩散，还微调了这些酶的固有活性[16, 17]。全面理解体内高效受限酶催化的机制对于设计具有更高性能的先进酶催化剂至关重要，以适应工业应用。

在体外构建酶催化剂时，也采用了受限催化策略来提高催化效率。例如，底物通道效应——即中间体直接在活性位点之间传递——已被用于多酶复合体中，设计出基于DNA支架的受限级联酶催化，从而将活性提高了数百倍[18, 19, 20]。此外，当支架或组装的酶对反应中间体具有亲和力，或者支架促进酶对聚集时，也可以显著提高催化性能[21]。包括DNA [18, 22, 23]、RNA [24]、蛋白质 [25]、金属有机框架（MOFs）[26, 27, 28, 29]等在内的多种材料已被用来创建限制环境，以提高酶的活性、稳定性和可重复使用性[30, 31, 32]。此外，使用中性聚合物的大分子拥挤也被用来模拟细胞内环境，从而提高酶的活性[33]。

在受限环境中，酶的固有活性通常会降低[34]，这是由于质量传递限制[35, 36]、微环境变化[37]和构象变化[38]等多种因素造成的。然而，也有例外情况，即酶的活性在受限条件下反而会增加，这为应用开辟了新的途径。例如，当漆酶和碳酸酐酶被纳入Cu₃(PO₄)₂·3H₂O纳米花中时，观察到它们的活性得到了增强[39]。有研究表明，Cu²⁺与酶的氨基酸残基之间的相互作用可能增强了酶的活性。Farha等人[40]报告称，封装在分层MOFs中的细胞色素c的构象变化使得反应底物更容易接近活性位点，从而提高了活性。然而，在许多情况下，关于受限微环境如何影响酶活性的全面理解仍然不足。关于如何设计受限酶以提高其固有活性的原理仍然很少。

在这项研究中，我们通过实验和理论计算相结合的方法，以枯草芽孢杆菌脂肪酶A（BSLA）为模型系统，研究了限制因素如何影响酶的固有活性。当在BSLA催化过程中引入不同聚合物的大分子拥挤时，酶的活性在不同程度上得到了增强。我们的分子动力学（MD）/经验价键（EVB）模拟结果表明，对BSLA环区施加限制会提高其固有活性，这种增强源于焓和熵的增加。受限的脂肪酶构象使得活性位点的预组织更好，初始状态和过渡状态之间的构象空间重叠更大。这种限制可以合理设计用于构建先进的酶催化剂。这一现象在PETase中也得到了观察，表明其潜在的普遍性。我们的工作揭示了通过微调限制来增强酶固有活性的方法，并阐明了在受限或拥挤条件下调控酶活性的机制。

实验片段

BSLA活性测定

底物

NPB

溶解在异丙醇中，测定缓冲液包含20 mmol/L Tris、300 mmol/L NaCl，pH = 8.0，以及不同类型、聚合度和浓度的大分子拥挤剂。活性测定的反应体系配置如下：20 mmol/L Tris、300 mmol/L NaCl、pH = 8.0的缓冲液或含有拥挤剂的缓冲液，酶溶液的最终浓度为94.7 nmol/L。将

NPB

添加至最终浓度为0.5

受限条件下BSLA活性的增强

在细胞条件下，存在大量大分子和拥挤的微环境（图1(a)）。为了模拟这些受限的催化条件，我们在BSLA催化过程中引入了多种聚合物拥挤剂，包括聚乙二醇（PEG6k）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP40k, PVP58k）和Ficoll70。我们使用

-硝基苯丁酸（

NPB

）作为底物，测量了引入这些限制剂后活性的变化。在大分子拥挤的情况下，BSLA的活性在25

结论

总之，我们通过实验和模拟对表面限制对BSLA活性的影响进行了全面研究。通过广泛的EVB/MD模拟，我们确定了实验中BSLA在受限条件下活性增强的原因，这似乎是设计受限酶的一般原理。特别是在酶的环区引入表面限制可以增强其固有活性，这种增强是由多种因素共同驱动的

电子支持信息

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致谢

作者感谢UCL Myriad高性能计算设施（Myriad@UCL）及相关支持服务在完成这项工作中的作用。