合成共生与合成生物学融合：构建高效生物固氮与固碳系统的新蓝图

《The Crop Journal》：Biological nitrogen and carbon fixation: Bridging the gap between synthetic symbioses and synthetic biology

为解决传统农业对化学氮肥的依赖及光合作用效率瓶颈，研究人员聚焦生物固氮(BNF)与碳固定领域，通过合成共生策略与合成生物学技术重构nif基因簇、设计非天然CO2固定模块，提出跨尺度工程化路线。该研究为低排放农业和生物制造提供了整合性解决方案，标志着氮碳循环调控从自然仿效向人工编程的范式转变。

　　

当我们谈论现代农业面临的挑战时，有两个看似平凡却至关重要的化学反应站在舞台中央：生物固氮（BNF）将空气中惰性的氮气（N₂）转化为植物可吸收的氨（NH₃），而光合碳固定则把温室气体二氧化碳（CO₂）变成生命所需的有机碳骨架。然而，自然界的这些过程却存在诸多局限——固氮酶对氧气极度敏感，需要消耗大量ATP能量；卡尔文循环中的Rubisco酶效率低下，还会因光呼吸作用浪费能量。随着气候变化加剧，高温和干旱压力进一步制约着这些自然系统的效能。工业合成氨虽然喂养了全球一半的人口，但其代价是消耗全球2%的化石能源，并贡献了显著的CO₂和N₂O排放。

在这一背景下，河北农业大学的程琪、马楚康和王雪璐团队在《The Crop Journal》上发表了一项开创性研究，提出了一个连接合成共生与合成生物学的概念路线图，旨在将脆弱的自然过程转化为可编程的高效系统。研究人员系统梳理了近年来在生物固氮和碳固定工程化领域的关键突破，并提炼出跨尺度的设计原则，为实现低排放农业和碳负性生物经济指明了方向。

为开展这项研究，团队运用了多组学分析、合成生物学工具开发（如遗传工具包构建和基因回路设计）、人工智能辅助蛋白质设计（包括AlphaFold2和RFdiffusion等平台）、细胞无系统原型验证、金属中心重构技术以及跨物种基因转移策略（如将nif基因簇导入真核生物细胞器）。特别值得一提的是，研究还涉及了材料-生物界面工程（如钼基纳米材料增强固氮）和微生物群落工程（如合成共生体系构建）等前沿交叉技术。

合成共生

异源表达和模块化转移氮酶基因簇（从原核生物到真核生物）

通过重构包含13个基因（约40 kb）的氮酶生物合成途径，研究人员在水稻中实现了11种Nif蛋白的表达和NifDK四聚体的形成。他们发现NifH在植物细胞质中不稳定，但通过定向进化获得了抗蛋白酶切割的变体，恢复了铁蛋白活性。这表明真核生物细胞器（如线粒体和叶绿体）可作为更理想的固氮酶“宿主”区室，特别是采用线粒体信号肽驱动的多蛋白系统可实现酵母线粒体中所有组分的协调表达。

工程化植物相关固氮菌用于非豆科作物固氮

在根际合成共生体系中，工程化的固氮菌被引入非共生植物的根区，利用根系分泌物中的碳源和低氧微环境进行固氮。研究人员重新编程了根际微生物组，将nif基因簇的表达与植物根系信号（如类黄酮）耦合，使固氮酶仅在根际微环境中激活。在MIT团队的研究中，Voigt课题组对水稻、玉米和小麦相关的天然固氮菌进行改造，移除能耗浪费的回路，使固氮酶仅在根系化学信号存在时表达。

工程化结瘤：迈向类根瘤微环境

尽管在非豆科主食作物中工程化结瘤仍处于早期阶段，但研究人员已开始探索创建类根瘤微环境以支持固氮细菌。通过引入重构的氮酶生物合成途径到水稻中，实现了多个Nif蛋白的细胞质表达和稳定NifDK四聚体的形成，同时鉴定了NifH的特异性切割位点并获得了抗降解的变体，为在谷物中实现完整固氮系统奠定了技术基础。

跨王国平台的赋能技术（底盘工具包和钼基材料）

研究人员开发了针对非模式固氮菌（如自养黄色杆菌Xanthobacter autotrophicus）的遗传工具包，验证了广宿主质粒、启动子和终止子的功能。同时，钼基策略通过两条路径推进：一是钼纳米肥料提高豆科和禾本科作物中的生物固氮；二是钼基电催化剂用于常温氮还原反应（NRR），作为哈伯-博世法的低碳替代方案。

碳和能量调控在生物固氮中的作用

最新研究表明，碳源供应和能量代谢已成为限制固氮速率的主要因素。通过匹配固氮菌的碳偏好与根系分泌物特征，可提高单位植物碳的固氮输出。工程化能量耦合节点（如过表达丙酮酸脱氢酶）可增加ATP产量，而引入异源NADPH生成途径则能缓解固氮酶的“电子短缺”。动态调控策略利用FRET-based ATeam指标和2-OG生物传感器实时监测细胞内ATP和碳氮状态，实现脉冲式或条件性固氮，最小化ATP消耗。

合成碳固定途径

Crotonyl-CoA/Ethylmalonyl-CoA/Hydroxybutyryl-CoA（CETCH）循环

这一合成CO₂固定途径通过使用更快的羧化酶（如ECR）克服卡尔文循环的限制。该循环由17种酶组成，在体外可实现比天然卡尔文循环快20-200%的CO₂固定速率，且能耗降低20%。机器学习优化进一步将CETCH循环效率提升十倍。

Malyl-CoA-Glycerate（MCG）途径

该合成途径将光呼吸中间体（如乙醇酸和乙醛酸）引导至乙酰辅酶A（acetyl-CoA）合成，形成封闭的碳守恒旁路。在概念上，MCG与其他碳正性光呼吸旁路（如TaCo途径）互补，为微生物和光合底盘中的光呼吸工程提供了替代设计空间。

光呼吸旁路

通过插入工程化酶将光呼吸副产物2-磷酸乙醇酸直接转化为3-磷酸甘油酸，显著减少了能量损失。在拟南芥中验证的“GOC旁路”（包含三种细菌酶：乙醇酸氧化酶、草酸氧化酶和过氧化氢酶）使CO₂同化率提高20-60%，且在不同CO₂浓度下均表现稳健。

新型CO₂活化酶

除了以Rubisco为中心的策略外，合成代谢正在扩展用于碳同化的酶工具箱。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（Ppc）和巴豆酰辅酶A羧化酶（Ccr）等替代羧化酶因其比Rubisco更高的催化速率而成为高通量羧化模块的吸引人切入点。

将细菌叶绿素引入植物

探索将细菌叶绿素引入植物光合系统以扩展光吸收光谱并提高远红光利用效率。尽管仍处于理论和初步转基因验证阶段，但引入叶绿素d或f到作物或藻类中可能通过扩大可用光光谱来提高光合效率。

非天然酶概念

基于AI的酶设计

深度学习平台（如AlphaFold2、RFdiffusion和ProteinMPNN）已计算生成数万种先前未知的酶支架。通过体外途径测试、高通量组合筛选和体内实施的迭代优化，实现了活性和稳定性的显著提升。在光催化固氮中，通过缺陷工程和界面调控创建了类FeMoco（铁钼辅因子）位点，模拟天然固氮酶的几何和电子不对称性。

金属中心重构

通过将合成金属配体与蛋白质支架模块化组装，成功在人工金属酶中重现了Fe-Mo-S簇样活性。这些仿生构建体不仅深化了对固氮酶功能的理解，也为在环境条件下开发可持续的氨生产催化剂铺平了道路。

完全合成的酶-底物耦合

人工羧化酶已被直接嵌入CETCH循环，实现了CO₂的连续体外固定及其向C₅糖（如核酮糖-5-磷酸）的转化。通过将酶与热稳定磷酸酶和醛缩酶共包裹在多孔藻酸盐-聚乙烯醇珠中，该循环在30°C下以1.2 s^-1的速率周转，碳保真度超过85%。

天然催化剂的代表性实例：从DPOR到LPOR

DPOR（暗操作原叶绿酸酯氧化还原酶）到LPOR（光依赖原叶绿酸酯氧化还原酶）的进化过渡提供了一个案例研究，说明生物学如何利用量子力学现象（如电子隧穿、质子耦合电荷转移）来维持催化性能。LPOR是一种简化的光驱动氧化还原酶，利用光子能量以高时空精度启动和引导氢化物转移。

创建光依赖叶绿酸酯氧化还原酶（LCOR）的最合理猜想

受LPOR的启发，研究人员提出设计一种称为LCOR的类似催化剂。该酶将LPOR的架构经济性移植到由固氮酶样COR催化的姐妹反应上。现代AI工具使重新调整成为现实：AlphaFold2在毫秒内提供准确的LPOR突变体结构；扩散生成器可以采样叶绿酸在口袋内的数千种姿势；几何注意力网络标记出控制B环的最小残基集；序列设计算法优化这些位置以实现与新底物的π堆叠，同时保留光化学性质。

创建光利用固氮酶（LUN）的最理想猜想

尽管设计一个全新酶如LUN的复杂性令人望而生畏，但现代AI将数百年的盲目进化搜索压缩为GPU加速的探索，提出了人类直觉无法发现的支架和催化三联体。如果成功实现，光利用固氮酶可能为可持续固氮提供替代概念路线。

通过合成设计实现卓越的酶-底盘协调

无细胞系统提供了一个可控的体内前测试平台，通过独立调整ATP再生、氧化还原供应、大分子拥挤和代谢物池来模拟目标区室，从而在稳定植物转化之前快速排名酶变体和预验证协调模块。

研究结论与展望

该研究强调，合成生物学正在经历从“微调自然”到“大胆新建”的范式转变。通过融合合成共生与人工酶，研究人员正在创建自修复、自优化的生物反应器，这些反应器可在环境温度和压力下固定N₂和CO₂，其效率超越陆生植物，甚至在某些情况下可与哈伯-博世法相媲美。

未来部署合成验证途径到活细胞中需要同时减少宿主负担、防止有毒中间体积累和最小化扩散损失。无细胞系统提供了一个实用的桥梁，在基因组整合之前规避这些限制。对于固氮酶在植物细胞中的部署，两个瓶颈——O₂保护和金属簇组装保真度——必须解决才能实现节能、自施肥的谷物。

多层共培养网络可以将代谢劳动分布在工程化伙伴之间，提高模块性和生态稳健性。合成光自养/异养菌群提供了具体的设计规则：工程化蓝细菌分泌固定碳作为蔗糖可以支持多样的异养生物，这种共培养可稳定数周至数月。生物电化学平台通过将还原力与有机碳解耦来扩展设计空间。

AI引导的设计-构建-测试-学习（DBTL）循环正在成为加速酶、调控部件和多菌株系统工程的实用途径。在这些工作流程中，机器学习模型提出候选序列或部件库；自动化构建步骤生成变体；高通量测定提供定量适应度测量；主动学习算法选择下一次迭代的最信息性实验。

最终，未来固氮工程的核心已转向“以最低碳成本和最高能量效率驱动固氮酶”。有三种策略：首先，在根-微生物界面调整碳流；其次，利用还原性C1原料进行陆地无关的氮转化；第三，在白天光合作用之外维持还原力。如果模仿DPOR→LPOR的自然简化范例，并使用AI设计一种新的光驱动固氮酶，使整个反应链直接由太阳能驱动，无需外部碳输入，我们可以将固氮酶转变为“光合氮工厂”，使生物固氮进入零碳时代。

这项研究不仅为可持续农业和生物制造提供了技术路线图，也展示了合成生物学在解决全球性挑战中的巨大潜力。随着定量系统生物学的进步和AI引导工作流程的发展，我们有望更精确地链接多组学数据与氮碳同化的机制模型，最终实现可编程、高效率的氮碳固定系统，为应对气候变化和粮食安全挑战提供创新解决方案。