《The Crop Journal》：Metabolic engineering for increased nutritional quality in rice
在当今社会，随着生活水平的提高，人们对食物的需求早已超越了单纯填饱肚子的阶段，开始追求吃得健康、吃得营养。然而，一个看似矛盾的现象却普遍存在：许多人虽然摄入了足够的热量，却依然面临“隐性饥饿”的威胁。这并非指肚子饿，而是指由于膳食中必需微量营养素（如维生素和矿物质）摄入不足所导致的健康风险。这种隐形的营养危机，正悄然增加着慢性疾病的负担，严重影响人们的生活质量。
作为全球半数以上人口的主食，水稻的地位举足轻重。但遗憾的是，精米加工过程会剥离掉富含微量营养素的麸皮和胚芽，使得我们碗中洁白晶莹的米饭，在满足能量需求的同时，却难以提供全面的维生素和矿物质。面对这一挑战，传统的育种方式因其周期长、效率低而显得力不从心。正是在这样的背景下，代谢工程这一新兴生物技术应运而生，它如同一位精准的“代谢建筑师”，旨在通过对水稻体内代谢通路的定向改造，让营养元素在可食用的胚乳中高效富集，从而培育出真正意义上的“营养稻米”。
发表在《The Crop Journal》上的这篇综述文章，由 Mingqi Zang、Shining Han、Ruixue Zhang、Ziwei Li、Peisong Hu 和 Zheyong Xue 共同撰写，系统梳理了利用代谢工程提升水稻营养品质的前沿进展。为了攻克营养强化的难题，研究人员主要运用了几项关键技术：代谢通路工程，通过引入或优化异源基因（如来自玉米的PSY基因、来自甜菜的BvCYP76AD1S基因）来构建或增强目标营养素（如维生素A、甜菜苷）的合成能力；基因组编辑技术，特别是CRISPR-Cas9系统及其衍生工具（如碱基编辑器、引物编辑器），用于精确敲除竞争性代谢路径的关键基因（如番茄中的Sl7-DR2基因以富集维生素D3前体）；多基因叠加系统（如GoldenGate、TGS II），实现复杂代谢途径中多个基因的协同表达；以及组织特异性启动子（如胚乳特异性谷蛋白启动子）的应用，确保营养物质在稻米可食用部位的特异性积累，避免对植株其他部位造成代谢干扰。此外，代谢组学全基因组关联分析（mGWAS）也被用于挖掘水稻种质资源中控制营养性状的关键遗传位点。
3. 近期通过代谢工程进行水稻营养生物强化的进展
3.1. 水稻营养生物强化概述
水稻的主要营养成分淀粉和蛋白质储存在胚乳中，而微量营养素（维生素、矿物质、天然产物）则集中在加工过程中被去除的外层。营养生物强化的目标是在可食用的胚乳中增加促进健康的化合物（维生素、矿物质、天然产物）的水平，以应对微量营养素缺乏——“隐性饥饿”。随着植物维生素途径的部分阐明，代谢工程已成为生物强化的关键。
3.2. 维生素A
维生素A是人体视觉、免疫和发育所必需的脂溶性微量营养素。研究人员通过引入微生物（欧文氏菌CRTI）和植物（水仙PSY/LCYB）基因到水稻胚乳中，创造了“黄金大米”，将β-胡萝卜素含量从检测不到的水平提高到1.6 μg g?1。后续研究通过整合来自玉米、菠萝和酿酒酵母的异源基因，使总类胡萝卜素含量达到14.2 μg g?1，比早期品系提高了8倍。
3.3. 维生素B1
维生素B1（硫胺素）是一种水溶性微量营养素，对人体能量代谢和神经功能至关重要。针对精米中维生素B1含量低的问题，研究人员采用胚乳特异性表达硫胺素生物合成关键基因（如THIC、THI1、TH1）的策略，成功使精米中的硫胺素含量增加了3倍。此外，表达芝麻来源的硫胺素结合蛋白（SiTBP）也使精米硫胺素含量增加了3-4倍。
3.4. 维生素C
维生素C（L-抗坏血酸，AsA）是植物中的抗氧化剂和人类的膳食微量营养素。通过在水稻胚乳中特异性表达关键限速酶基因（如OsPMM），研究人员成功将籽粒中的抗坏血酸含量提高到1761–2040 μg g?1，且对农艺性状无不利影响。
3.5. 维生素D
植物天然合成的维生素D含量可忽略不计。代谢工程提供了一种有前景的解决方案：通过重新设计植物代谢网络以积累维生素D前体并优化其向活性维生素D的转化。在番茄中，通过CRISPR介导的敲除Sl7-DR2基因（编码7-脱氢胆固醇还原酶），增加了7-脱氢胆固醇（7-DHC）含量，进而通过紫外线照射转化为维生素D3，在果实中积累了相当于成人每日摄入量20%的维生素D3。这为创建高产维生素D3水稻提供了策略。
3.6. 维生素E
维生素E是一种必需维生素，人类和动物不能自身合成，必须从膳食来源获取。组成型表达维生素E生物合成基因虽能提高叶片中生育酚水平2.3倍，但未能增强胚乳含量，凸显了生物强化中组织特异性靶向的重要性。未来策略包括使用胚乳靶向启动子驱动HPT/HGGT/γ-TMT表达，以及共表达限速的MEP途径基因以增强前体供应。
3.7. 铁生物强化
铁是人体生理上最关键的铁微量元素，缺乏会导致缺铁性贫血（IDA）。通过在水稻胚乳中特异性表达来自菜豆的铁蛋白基因（PvFER1），转基因品系的胚乳铁含量比野生型对照增加了2.3倍，而其他微量元素（锌、锰、铜）浓度保持不变。
3.8. 锌生物强化
锌是人体内含量第二多的必需微量元素。研究人员鉴定了一个新基因OsZG（水稻锌粒重调节因子），该基因对调节水稻籽粒中的锌含量和粒重具有独特的协同效应。转基因水稻过表达OsZG可使籽粒锌含量增加1.8倍，同时提高粒重，克服了生物强化中常见的营养-产量权衡问题。
3.9. 硒生物强化
硒是人体健康必需的微量元素，缺乏会导致免疫力下降和克山病、大骨节病等疾病风险增加。通过利用线粒体谷胱甘肽过氧化物酶基因启动子（OsGPX3p）驱动修饰的ASTOL基因表达，不仅增强了砷抗性，还促进了根部烟酰胺合成酶（OsNAS）的表达，从而将锌、铁、硒等必需微量元素转运至籽粒，增加了这些元素在籽粒中的含量。
4. 水稻中天然产物的代谢工程
4.1. 甜菜苷
甜菜苷是一种源自植物液泡的天然色素，因其优异的亲和力和着色强度而被广泛用作食品和化妆品中的着色剂。通过在水稻胚乳中表达一组经过密码子优化的甜菜苷生物合成核心基因（meloS、BvDODA1S、BvCYP76AD1S），研究人员成功培育出能够生产甜菜苷的工程化水稻，其含量高达159.5 μg g?1干重。
4.2. 花青素
花青素是存在于蓝莓、桑葚、黑枸杞等植物中的色素，具有抗氧化、抗衰老、免疫调节和心脏保护特性。通过利用高效的多基因叠加系统（TGSII）引入外源花青素生物合成基因，并在胚乳特异性启动子控制下表达，研究人员创造了“紫色胚乳米”，其胚乳中花青素含量超过1 mg g?1干重。然而，在粳稻背景的转基因株系中观察到粒重下降（8%–12%），揭示了花青素生物合成与库强度之间潜在的代谢权衡。
4.3. 儿茶素
儿茶素是茶的成分，以其清除超氧阴离子自由基和羟基自由基的能力而闻名。研究人员构建了两组含有儿茶素生物合成基因的表达载体，由胚乳特异性启动子驱动。转基因品系II的总儿茶素含量达到532.2 μg g?1，DPPH和ABTS抗氧化测定表明其自由基清除能力比野生型籽粒提高了3倍。但同样观察到籽粒大小和千粒重下降，表明碳流向儿茶素生物合成的重定向会影响籽粒灌浆期间的库强度。
4.4. 樱花素
樱花素是一种类黄酮植物抗毒素，在水稻受到病原体侵染时会迅速诱导产生，通过破坏细胞壁完整性和抑制病原菌（如稻曲病菌和稻瘟病菌）的菌丝伸长而发挥强大的抗真菌活性。通过在水稻胚乳中特异性表达樱花素生物合成关键酶基因（OsNOMT，编码柚皮素7-O-甲基转移酶），成功实现了樱花素在胚乳中的积累。樱花素的双重作用——在植物体内作为抗真菌化合物，在人体内作为具有抗氧化活性的膳食类黄酮——使该策略成为开发集抗病性和营养强化于一体的“多功能水稻”的范例。
4.5. 染料木素
染料木素是一种类黄酮次级代谢产物，天然存在于豆类食物中，对神经退行性疾病、心血管疾病和癌症等年龄相关疾病具有治疗潜力。研究人员通过构建含有大豆来源的染料木素生物合成关键基因的表达载体，并将其导入水稻植株，成功实现了染料木素在粳稻胚乳中的生产。
5. 生物反应器
植物种子是植物体内合成和储存蛋白质、淀粉等物质的主要器官，具有高蛋白含量和低蛋白酶活性的特点，使其成为理想的生物反应器。水稻作为谷物植物，具有成熟的种植、收获、储存和加工工业体系，便于大规模生产。其自花授粉特性降低了随机基因流动的风险。作为种子，水稻可以高效表达重组蛋白，如抗体和疫苗抗原。稻米可直接食用，这有利于生产可食用疫苗和治疗性蛋白。
5.1. 人血清白蛋白
人血清白蛋白（HSA）是从健康人血浆中提取的蛋白质，占血浆总蛋白的50%以上，主要功能是维持血液渗透压和运输激素、脂肪酸等物质。研究团队将优化后的能生产人血清白蛋白的基因（OsTDC）导入水稻，实现了重组HSA的大规模生产，从转基因水稻中分离纯化出的HSA纯度超过99%，浓度达到2.75 mg g?1稻米。水稻生产系统避免了人和动物病原体的污染，且纯化后的纯度也符合监管要求。
5.2. 5-羟色胺
5-羟色胺（5-HT）是一种单胺类神经递质，在调节动物睡眠-觉醒周期中起关键作用。在胚乳特异性启动子控制下表达目标基因的转基因水稻品系中，5-HT在胚乳中高度富集，且不影响植株生长或籽粒理化性质。利用人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞进行的体外试验表明，这些转基因品系的胚乳提取物能减轻H2O2诱导的氧化应激（细胞凋亡减少32% ± 4.1%）并保护线粒体膜电位，显示出神经保护活性。
5.3. “新型冠状病毒”重组S1疫苗
SARS-CoV-2的刺突（S）蛋白是一种抗原，通过识别血管紧张素转换酶2（ACE2）受体介导病毒附着于宿主细胞，随后发生膜融合，这是病毒进入的关键步骤。研究人员通过用含有不同启动子的载体转化水稻植株，使水稻能够表达SARS-CoV-2 S1蛋白。产生的转基因水稻品系正常表达rS1蛋白，且不影响粒型和粒重。功能验证表明，纯化的rS1配以氢氧化铝佐剂肌肉注射BALB/c小鼠后，能诱导强烈的体液免疫。储存在水稻胚乳中的rS1在25°C下能保持抗原性≥12个月，并在模拟胃消化（pH 2.0, 2小时）后保持稳定性，凸显了水稻胚乳作为低成本、热稳定疫苗递送平台的潜力。
5.4. 血凝素-神经氨酸酶
血凝素-神经氨酸酶（HN）是副粘病毒（如新城疫病毒、人副流感病毒）的一种包膜蛋白，介导病毒感染的两个关键步骤：通过其血凝素结构域与宿主细胞上的唾液酸受体结合，以及通过其神经氨酸酶结构域切割唾液酸以促进病毒释放和传播。研究团队利用水稻胚乳表达系统，通过驱动一个经过密码子优化的HN基因（合成基因，含有85%的水稻偏好密码子）的表达，开发了一种高效的重组抗原Osr2HN。该团队在精米中实现了Osr2HN的积累，浓度为3.7 μg g?1干重，比组成型启动子驱动系统高3倍。小角X射线散射（SAXS）晶体结构分析表明，重组Osr2HN蛋白形成正常的四聚体结构，其受体结合域和中和表位完全暴露，能够作为抗原发挥作用。
6. 水稻营养强化代谢策略总结
6.1. 基因组编辑技术的应用
靶向基因组编辑技术，特别是CRISPR系统，因其简单性、可编程性和精确性而提供了变革性的解决方案。核心CRISPR平台已被设计用于创建先进工具，如碱基编辑器（能够在没有双链断裂的情况下实现精确的点突变）和引物编辑器（能够进行所有碱基替换和小片段插入/缺失），极大地扩展了我们修饰作物性状的能力。例如，通过CRISPR/Cas9介导的敲除番茄中的Sl7-DR2（7-脱氢胆固醇还原酶），可将代谢流转向维生素D3前体的生物合成。为了消除编辑作物中的残留转基因，已开发了三种转基因消除系统，如Transgene Killer CRISPR系统（TKC）、TGAC策略和TKCv2，它们结合了高效率和环境生物安全性。
6.2. 代谢途径的多基因转化和mGWAS辅助育种
与基因敲除相辅相成，在胚乳中表达异源生物合成途径是一项主要策略。模块化组装系统如GoldenGate和TGS II现在允许无缝整合10-15个基因，从而能够重建复杂途径并显著提高产物积累。然而，高水平表达可能产生代谢负担，有时会导致如粒重下降等权衡。代谢物全基因组关联研究（mGWAS）策略能够高通量筛选多样种质，以鉴定控制营养性状的遗传位点。例如，研究鉴定了水稻中与硫胺素积累相关的两个主要位点，并证实了特定单倍型组合可将精米中的硫胺素含量提高6.1倍，展示了如何利用内源遗传变异进行精确营养强化，而无需通常与异源途径工程相关的代谢负担。
6.3. 天然产物共享代谢途径的协同调控
为了实现来自共享苯丙氨酸枢纽的多种高价值代谢物（如花青素、儿茶素、樱花素）的靶向强化或协同生产，必须克服前体供应不足和代谢流分布不平衡这两个相互关联的瓶颈。成功依赖于三个战略层面的协同应用：前体优化、精确途径分流和转录网络协调。优化上游前体供应是多种代谢物积累的基本前提。精确控制分支点的代谢流对于将前体导向特定的目标化合物至关重要，这通常通过具有高底物特异性的酶来实现。转录因子（TFs）协调整个途径基因的时空表达，能够平衡前体合成和产物形成。
6.4. 常见挑战：代谢负担及解决方案
一个普遍的挑战是代谢负担，即工程化的营养途径与初级代谢（如淀粉合成）竞争碳和氮，可能对产量造成不利影响。淀粉合成酶活性在开花后7-10天达到峰值，而花青素合成基因的表达水平在开花后1-2周上调，花青素积累在开花后7天开始，并在开花后18天左右达到最大。这种碳源竞争可以通过应用“发育阶段特异性启动子”来有效缓解。将异源基因表达与内源信号（如糖水平或脱落酸浓度）联系起来，可以仅在碳和能量供应充足时激活资源密集型途径，从而最大限度地减少与植物生长发育的权衡。碳源分配是优化代谢工程作物产量的另一个目标，可通过数量性状基因座（QTL）作图和精确基因编辑来实现。
6.5. 人工智能辅助育种
人工智能驱动工具（如CRISPR-GPT）利用大型数据集和机器学习来自动化和优化基因组编辑设计，提高准确性和效率。该平台通过生成经过超过12,000个实证案例验证的优化实验方案，简化了多种基于CRISPR的基因组编辑工作流程。人工智能引导的酶优化是合成生物学的前沿策略，它整合了机器学习（ML）、持续定向进化（CDE）和超高通量筛选，以快速改造具有增强催化效率、改变底物特异性或新产物谱的酶。人工智能驱动的智能育种，整合了生物技术和机器学习，带来了农业遗传学的变革性进步。
6.6. 使用专用肥料增强作物营养
在植物生长期间外源施用营养素（如叶面喷施硒）是提高水稻营养品质的常用农艺策略。硒的施用可以增加籽粒硒含量，提高其膳食价值。纳米硒（nano-Se）等先进技术相比硒酸钠等传统形式，进一步改善了养分输送和生物利用度。然而，外源施用的有效性取决于营养素。外源添加硫胺素（维生素B1）可能会破坏内源生物合成并对植物-微生物相互作用产生负面影响，最终损害生长。部署此类策略需要仔细评估其对内源代谢和关键农艺性状的影响。
7. 营养强化稻米的前景及推广策略
7.1. 新兴技术与消费者对生物强化米的消费意愿
消费者接受生物强化米的意愿受到对新兴生物技术，特别是基因工程的担忧的阻碍。近65%的消费者对生物强化米是否经过基因改造表示担忧，这直接阻碍了购买决策。这对于能够获得替代营养来源（如补充剂和功能性食品）的城市人群尤其相关。因此，向该群体有效推广生物强化米，需要在传达产品优势的同时解决这些担忧。
7.2. 营养强化米新兴技术对农民采纳意愿的影响
在大多数发展中国家（如中国）城乡营养摄入差距普遍的背景下，强化米这一新兴技术对农民采纳意愿的影响与农村地区面临的微量营养素缺乏和生产限制内在相关。小规模农户对种植营养强化作物及其潜在价值的了解有限且过时。在引入新技术时，农民需要考虑消费者是否会接受营养强化产品。因此，当农民采用营养强化作物替代传统主粮作物时，他们可能会担心强化品种与传统品种之间的农艺差异。营养强化作物的推广需要超越对农民进行核心技术原理教育的多层面战略。同样关键的是投资于提高水稻生长和产量的支持性基础设施，引导采纳降本增效的新兴技术，并确保可靠的市场准入，从而为农民带来更大的经济回报。
7.3. 营养强化代谢作物的标准化与改进
作为通过农业政策解决营养差距的发展中国家的领先范例，中国农业农村部近期发布了锌强化小麦和叶酸强化玉米等产品的行业标准。在此监管基础上，必须通过系统的田间观察和评估，建立和完善营养强化水稻的标准化框架。该框架应优先考虑清晰的标签，以根据营养概况和基因改造状况区分水稻品种。制定大规模生产规程和完善质量评估标准对于促进该产业的可持续发展至关重要。
8. 结论
生物强化代谢工程已取得显著进展，包括开发出“黄金大米”和富含花青素的紫色胚乳米。当前研究表明，代谢工程已成功提高了水稻中维生素、矿物质和活性天然产物的水平，将其转变为一种生物反应器。然而，代谢工程也面临持续挑战：平衡产量与营养强化、产物向特定组织的靶向效率低、以及社会对转基因作物的犹豫。先进工具的整合，包括基于CRISPR的基因组编辑、模块化多基因叠加系统和人工智能驱动设计平台，为重新编程代谢网络提供了前所未有的精确度。然而，它们的成功部署取决于克服碳流竞争、对农艺性状的多效性影响、以及目标化合物在储存和加工过程中的稳定性等瓶颈。未来的努力必须采用整合的“途径×农艺”策略，利用阶段特异性启动子、动态调控回路和内源遗传变异（如mGWAS鉴定的位点）来协调营养积累与产量和胁迫恢复力。未来的研究将把重点从离散性状强化转向通过合成生物学协调工程化多功能水稻。未来的研究将专注于开发下一代工具，如响应内源信号的动态调控启动子和亚细胞区室化策略，以提高途径效率和产物稳定性。多组学数据与人工智能预测模型的整合将进一步实现对复杂营养性状的精确工程化，同时保持农艺适应性。除了技术创新，生物强化米的成功部署还需要在建立基于科学的监管框架、负担得起的营养检测方法和包容性供应链方面取得并行进展。重要的是，通过透明的沟通和参与式方法培养公众信任对社会采纳至关重要。最终，通过架接前沿科学与社会经济和生态考量，代谢工程水稻可以转变为全球营养安全可扩展、可持续的支柱，为不同社区的隐性饥饿和预防性医疗提供切实的解决方案。
