《Current Research in Food Science》：Structural modification of egg white proteins enhances electrostatic complexation with sodium alginate and hydrogel particle formation: mechanistic insights and functional applications
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本研究针对鱼油等易氧化生物活性物质在功能食品中应用受限的难题，通过pH调节(pH-shifting)和热处理对蛋清蛋白(EWP)进行结构改性，显著提升了其与海藻酸钠(NaAlg)的静电复合能力及水凝胶颗粒形成效果。研究发现pH 13结合50°C处理可最优暴露色氨酸/酪氨酸残基，增加蛋白柔性，形成分布均匀的水凝胶颗粒，成功封装鱼油乳液并显著提升其氧化稳定性和分散性。该研究为球形蛋白在功能食品体系中的应用提供了新策略。
在许多食品加工过程中，蛋黄常被作为主要原料用于制作蛋黄酱、烘焙混合物、酱料和冰淇淋等产品，而蛋清则往往成为被剩余的副产品。蛋清蛋白是一类营养价值极高的物质，其主要成分包括54%的卵白蛋白、12%的卵转铁蛋白、11%的卵类粘蛋白、3.5%的卵粘蛋白和3.4%的溶菌酶。这些蛋白质因其显著的抗氧化活性，被认为是构建水凝胶颗粒的理想材料。然而，蛋清蛋白天然的球状结构限制了其在形成此类复合物中的功能性，因此需要进行结构改性。
鱼油作为代表性的多不饱和脂质，主要包含omega-3脂肪酸，如二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)。这些长链多不饱和脂肪酸以其多种健康促进特性而闻名，包括抗炎活性、心血管保护和潜在的认知益处。尽管有这些公认的优点，但由于其较差的水分散性和高度易受氧化降解的特性，鱼油在食品应用中的利用仍然有限。
针对这一挑战，研究人员开展了一项创新性研究，通过pH调节和/或温和热处理对蛋白蛋白进行结构改性，改变其构象结构和亲水性，然后利用改性蛋清蛋白(MEWP)和海藻酸钠通过静电复合制备水凝胶颗粒。该研究论文发表在《Current Research in Food Science》上，为解决易氧化活性化合物的封装和保护提供了新的思路和方法。
研究人员采用了多项关键技术方法开展本研究。他们通过pH调节处理(调整pH值从2到13)和热处理(40-80°C加热10分钟)对蛋清蛋白进行结构改性，并使用紫外-可见光谱(UV-vis spectroscopy)分析蛋白质构象变化。表面疏水性(H0)通过ANS荧光探针法测定，蛋白质聚集状态通过尼罗红(Nile Red)荧光法评估。利用Zeta电位分析仪在不同pH条件下测量蛋白质表面电荷特性。通过高压微射流均质技术制备10%的鱼油水包油(O/W)乳液，并采用静电复合法构建未填充和填充的水凝胶颗粒。使用光学显微镜和共聚焦扫描激光显微镜观察样品微观结构，通过静态光散射法测定颗粒尺寸，并采用氢过氧化物测定法评估脂质氧化程度。
3.1. 通过pH调节或/和热处理对EWP进行改性
研究结果显示，球状蛋白质具有由静电作用和某些弱力稳定的紧凑球形结构。在天然状态下，蛋白质优先将亲水基团朝向水环境，同时将疏水基团折叠在其内部，从而最大化热力学稳定性。紫外-可见光谱结果表明，经过pH调节处理后，EWP的紫外-可见光谱发生了显著变化，在pH 12和13处理的样品中观察到最显著的变化。EWP在280 nm处的紫外吸收强度在pH 13和12处理后分别从1.62增加到1.84和2.11。EWP在280 nm处紫外吸收增加与芳香族氨基酸色氨酸和酪氨酸的更大暴露有关。这表明pH调节处理可以部分展开紧凑的球状EWP蛋白，暴露先前埋藏的疏水区域，并可能增强蛋白质的结构灵活性。
当处理温度达到60°C时，EWP的吸收强度增加，表明热处理也能诱导EWP的构象变化。将温度进一步升高到70°C会导致絮状沉淀的形成，而EWP溶液在80°C时转变为半固态。为了评估pH调节和热处理对EWP的联合改性效果，对在pH 2、3、12和13处理的样品进一步在50°C和60°C下进行热处理。紫外-可见光谱结果表明，联合处理比单独的pH调节或热处理引起更显著的吸收强度变化。这表明在pH调节后，EWP对热处理变得更加敏感，并且联合处理可以进一步促进EWP的构象变化。
3.2. pH调节或/和热处理改性的EWP的物理化学性质
表面疏水性(H0)代表了蛋白质表面疏水区域的存在和分布，这些区域在蛋白质处于天然状态时通常位于蛋白质核心的疏水结合口袋内。研究结果显示，经过pH调节处理(pH 3和13)后，EWP的表面疏水性显著增加，而单一热处理(50°C或60°C)的效果不显著。联合处理也进一步增加了EWP的表面疏水性，这与紫外-可见光谱中观察到的变化一致。这种表面疏水性的增加可归因于EWP的显著构象变化，导致原本包裹在其致密球状结构中的疏水侧链基团暴露出来。
使用尼罗红评估蛋白质聚集情况，当与蛋白质表面的疏水区域结合时，尼罗红会发出更强的荧光。与单体相比，其在聚集体中的荧光会增加，这使得它可用于检测蛋白质聚集。结果表明，EWP聚集状态的变化与其表面疏水性的变化相似，这种相关性表明在这些处理条件下，表面疏水性的增加是蛋白质聚集的主要驱动力。
蛋白质的表面电荷主要来自表面基团的电离，特别是组成氨基酸的酸性和碱性侧链，表明其受蛋白质三维结构变化的影响。EWP的报道等电点(pI)约为4.5-4.8。研究结果显示，天然EWP在pH 4.5时的Zeta电位为正值，表明蛋白质在其等电点以下携带净正电荷，这为与阴离子藻酸盐的复合提供了静电驱动力。pH调节和加热联合处理略微降低了EWP的Zeta电位，表明改性后表面电荷密度降低，这可归因于结构重排，并可能促进了先前埋藏的羧基基团的暴露，改变了蛋白质表面质子化氨基基团和去质子化羧基基团之间的平衡。
3.3. 未填充和填充水凝胶颗粒的结构表征
为了确定适合形成水凝胶颗粒的组分，研究人员选择了天然EWP和两种改性EWP来研究它们在pH 4.5下与海藻酸钠形成静电复合物的能力。选择50°C作为最佳条件，因为它提供了与60°C相当的蛋白质表面暴露度，同时需要更低的能量输入。不同样品的微观结构通过光学显微镜和共聚焦扫描激光显微镜进行表征。结果显示，在pH 4.5的天然EWP-海藻酸钠混合物中没有形成可见的颗粒，表明是一个单相体系。可以推测，EWP和海藻酸钠可以以可溶性复合物形式存在，导致单相体系。
随着蛋白质结构通过pH调节或/和热处理展开，在pH 4.5逐渐形成具有不同形态的水凝胶颗粒，显示pH 13处理的EWP形成不规则和部分聚集的颗粒，而pH 13 + 50°C处理的EWP形成形状更规则、尺寸均匀的颗粒。未填充水凝胶颗粒的结构特性与填充的相似，表明当油滴被包封时，水凝胶的形态和尺寸没有改变。与单独的pH调节相比，额外的温和热处理可能进一步增强了分子流动性和结构重排，允许部分展开的蛋白质采用更灵活但仍连贯的构象。这种展开和结构完整性之间的平衡对于与藻酸盐的有效静电复合以形成形状更规则、尺寸均匀的颗粒可能至关重要。
共聚焦图像显示，在pH 4.5下，MEWP和海藻酸钠形成了大量微米级的水凝胶颗粒，表明大多数MEWP参与了水凝胶颗粒的形成。相比之下，当使用天然EWP制备水凝胶颗粒时，没有观察到可见的微米级颗粒。对于10%的鱼油水包油乳液，小的脂质滴分布在整个溶液中。对于填充的水凝胶颗粒，大多数脂质滴被包埋在富含MEWP的水凝胶颗粒内部，形成O/W1/W2结构。
颗粒尺寸分析显示，初始的鱼油水包油乳液包含相对较小的脂质滴，粒径分布单峰位于约0.35 μm (D32)。填充水凝胶颗粒的粒径分布显示单峰约2.9 μm (D43)，甚至小于没有脂质滴的未填充水凝胶颗粒(D43= 3.4 μm)。填充水凝胶颗粒显示出最小的Span值(1.32)，表明填充水凝胶颗粒的尺寸均匀性优于未填充水凝胶颗粒和原始乳液。
基于这些数据，未填充颗粒的较大尺寸可以通过在无油情况下形成更松散交联和高度膨胀的MEWP水凝胶网络来解释。相比之下，油的掺入促进了蛋白质在油水界面的吸附，这减少了本体网络的形成，并导致填充颗粒中形成更致密、不易膨胀的结构。水凝胶颗粒的尺寸可以通过调节剪切力来调整。较小的尺寸可能会阻碍亚微米级O/W乳液的包封，而较大的尺寸可能会影响水凝胶颗粒的稳定性。
3.4. 填充水凝胶颗粒对脂质氧化的保护作用
氢过氧化物是主要的氧化产物，它们的形成和积累是脂质氧化的重要指标。研究结果显示，简单乳液中的氢过氧化物浓度在储存两天后急剧上升，随后下降，这是与初级氧化产物分解为次级氧化化合物相关的典型氧化行为。相比之下，在填充水凝胶颗粒中，氢过氧化物的产生在储存期间显著较低。此外，在填充水凝胶颗粒中没有观察到链增长阶段典型的氢过氧化物快速形成。在链增长阶段，自由基的指数级增加通常导致氢过氧化物形成速率的急剧上升。
三个因素可以解释这些观察结果：首先，鱼油的包封减少了其与氧气的直接接触。与传统的O/W乳液不同，在O/W1/W2结构中，油滴被物理限制在蛋白质-藻酸盐水凝胶基质内。该基质作为一个致密的扩散屏障，限制了氧气传输并限制了反应性物质的流动性。其次，EWP和MEWP都表现出强大的抗氧化特性。值得注意的是，改性的MEWP显示出显著增强的抗氧化活性，这可能归因于pH和温度改性诱导的活性氨基酸侧链的暴露。第三，水凝胶颗粒可能通过物理分区抑制体系中的自由基增殖。具体来说，油滴在水凝胶基质内的空间限制限制了脂质自由基和过氧自由基在相邻油滴之间的转移，从而抑制了油滴间的链式反应。
除了影响乳液的营养特性外，脂质氧化还会改变其界面特性。结果显示，简单乳液中的鱼油在储存后聚集成大的、不规则的团簇，而填充的水凝胶颗粒保持了其原始形态。这些结果表明，将鱼油封装在水凝胶颗粒中不仅提高了其氧化稳定性，而且保持了其分散稳定性。
本研究通过pH 13 + 50°C处理获得的MEWP能够与海藻酸钠通过静电复合形成微米级且形状均匀的水凝胶颗粒。这归因于结构展开后EWP表面疏水性和结构灵活性的增加，促进了MEWP新暴露的疏水区域与海藻酸钠在pH 4.5下发生广泛的静电相互作用。鱼油乳液可以被包封在富含MEWP的分散相中，它们掺入水凝胶颗粒通过提供物理屏障和由MEWP创造的抗氧化环境有效地保护它们免受脂质氧化。此外，鱼油乳液在水相中的分散稳定性也得到了改善。这些发现对于扩展具有紧凑球状结构的高亲水蛋白在结构化乳液中的应用具有重要意义。该研究不仅为易氧化活性化合物的理性设计和制备提供了宝贵的见解，而且通过将分子设计与食品副产品的可持续利用相结合，为开发促进循环资源利用、减少食品浪费的创新递送系统做出了贡献。
