《Current Research in Microbial Sciences》：Integrated Metagenomic and Metabolomic Analysis Reveals Regional Style Differences in Maotai-Flavour Baijiu
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本研究针对赤水河流域三大酱香型白酒产区（茅台镇、金沙、仁怀）存在的风味风格差异问题，通过整合代谢组学与宏基因组学技术，系统解析了其第四轮酒醅与基酒的挥发性风味物质及微生物群落结构差异，并深入探究了微生物与风味代谢的关联机制。研究揭示了不同产区微生物群落构建机制（NST）的显著差异，明确了关键功能微生物（如Saccharomyces、Lactobacillus、Limosilactobacillus）及其代谢通路（如短链脂肪酸代谢）对地域风格形成的驱动作用，为区域特色化生产与工艺优化提供了重要的理论依据。
酱香型白酒作为中国传统固态发酵蒸馏酒的典型代表，以其“酱香突出、优雅细腻、酒体醇厚、回味悠长”的独特风格而闻名。其传统的“12987”酿造工艺在赤水河流域形成了独特的酿造体系。该流域地处云贵高原向四川盆地过渡的斜坡地带，以山地和丘陵为主，海拔落差大，形成了多样的小气候环境，这为酱香型白酒的区域风格差异提供了天然基础。富含矿物质的紫色砂页岩土壤和优质水源为酿造提供了理想条件。茅台镇、金沙县和仁怀市是赤水河流域酱香型白酒的三大主要产区。茅台镇作为酱香型白酒的发源地，采用传统“12987”工艺酿造出以茅台酒为代表的醇厚酱香型白酒；金沙产区因其气候较为凉爽，形成了柔雅酱香风格；而仁怀产区（涵盖茅台镇及周边区域）生产的酱香型白酒品类齐全，风格介于两者之间。尽管三地的酿造工艺和原料标准相似，但由于它们位于赤水河流域不同的微气候区，不同的地理环境、气候条件和微生态系统导致了酒醅的微生物群落和风味代谢特征存在明显的区域差异。目前，针对酱香型白酒的研究主要集中在茅台镇产区的风味物质分析或微生物多样性探索上，而对于不同产区酒醅的挥发性风味特征及其与微生物群落关联性的研究相对较少。特别是，金沙产区的“柔雅酱香”与茅台镇的“醇厚酱香”风格差异是否源于酒醅微生物及其代谢活动的不同，这一问题尚未得到解答。同时，作为茅台镇的延伸，仁怀产区的酒醅微生态及风味化合物如何受地理位置影响，也需要深入分析。为了解决这些问题，深入研究不同产区酱香型白酒风味形成的微生物学机制显得尤为重要。
为了深入探究酱香型白酒地域风格差异的微生物学本质，一项发表在《Current Research in Microbial Sciences》上的研究应运而生。该研究以同一家酒企在2024年生产周期中，位于茅台镇核心产区、金沙产区和仁怀产区的三个标准化生产车间的第四轮酒醅和第四轮基酒为研究对象（第四轮处于酿造中期，微生物和风味物质积累相对平衡）。研究人员开展了一项整合宏基因组学与代谢组学的分析。
本研究主要采用了以下几种关键技术方法：首先，在样本采集方面，研究从三大产区的标准化生产车间系统采集了第四轮发酵过程中堆肥发酵初期、堆肥发酵末期、窖池发酵末期以及本轮基酒等多个关键工艺节点的样本，每个时间点设三个生物学重复，共计36份样本，采用五点取样法确保代表性，并立即于-80°C保存备用。其次，在微生物群落分析上，采用宏基因组测序技术（使用Illumina Novaseq X Plus平台），对酒醅样本的总基因组DNA进行测序，以解析细菌和真菌的群落结构和功能潜能。第三，在风味物质检测方面，利用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HS-SPME-GC-MS）技术分析了酒醅中的挥发性风味化合物，同时采用气相色谱（GC）技术分析了基酒中的挥发性成分。此外，还组织了由8名经验丰富的品酒师组成的感官评价小组，对基酒的七项风味特征指标（焦香、曲香、酯香、花香果香、粮香、酸香、酱香）进行强度评分（1-5分）。最后，运用了多种生物信息学和统计学分析方法，包括归一化随机性比率（NST）分析、LEfSe分析、主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）、冗余分析（RDA）、Mantel检验以及网络相关性分析等，用于比较群落结构、识别标志性微生物、分析物质差异以及揭示微生物与风味物质之间的关联。
3.1. 不同产区酒醅微生物群落结构的NST分析
研究人员采用归一化随机性比率（NST）来量化三个产区真菌和细菌群落构建机制的差异。研究发现，真菌群落的随机性以金沙（JS）组最强，显著高于茅台（MT）和仁怀（RH）组，且仁怀组的随机性也显著高于茅台组。而细菌群落的构建机制则不同，金沙组表现出最强的确定性主导，其确定性显著低于茅台和仁怀组。总体而言，真菌更易受随机过程影响，而细菌则更受确定性过程驱动。不同产区的微生物群落构建机制具有特异性影响，其中金沙产区的两种微生物表现最为显著。这种差异对风味代谢具有深远的功能意义：金沙产区真菌组装的随机性可能促进了更大的功能多样性和代谢新颖性，从而有助于其复杂“花香果香”风味的形成；而茅台产区细菌组装的确定性，特别是对耐酸 specialists（如Limosilactobacillus）的强选择，建立了一个可预测且高效的代谢管道，直接塑造了突出的“酸香”并为“酱香”化合物的形成提供了前体。
3.2. 不同产区酒醅真菌群落结构分布
在门水平上，子囊菌门（Ascomycota）是所有样本中的绝对优势真菌。茅台产区的子囊菌门丰度最高，而毛霉门（Mucoromycota）的丰度相对较低。金沙产区的毛霉门丰度显著高于茅台和仁怀，表明其相对凉爽的气候条件可能保留了更多的嗜冷真菌。仁怀产区的真菌群落结构与茅台相似，但在窖池发酵末期，担子菌门（Basidiomycota）的丰度略高。在属水平上，三个产区的分布显示出明显的阶段性和区域性差异。金沙产区在发酵初期以接合酵母属（Zygosaccharomyces）和曲霉属（Aspergillus）为主，随着发酵进行，曲霉属和拟青霉属（Paecilomyces）逐渐成为优势菌属。茅台产区表现出典型的酿酒酵母（S. cerevisiae）富集特征，堆肥末期和窖池末期以酵母属（Saccharomyces）和毕赤酵母属（Pichia）为主。仁怀产区则表现出独特的真菌组成，窖池末期富集了哈萨克斯坦酵母属（Kazachstania），堆积阶段红曲霉属（Monascus）的高丰度可能影响酒体的色泽和风味。值得注意的是，茅台产区堆积初期曲霉属的水平显著高于其他地区，其富含淀粉和纤维素降解酶编码基因，并表现出氨基酸代谢通路活性升高，这与高温大曲工艺创造的高温、高湿、好氧微环境相符，暗示曲霉属在为美拉德反应和斯特雷克降解提供前体方面起关键作用。
3.3. 不同产区酒醅细菌群落结构分布
在门水平上，厚壁菌门（Bacillota）是所有样本中的优势菌门，其丰度在窖池发酵末期普遍增加。在堆积初期，金沙产区的厚壁菌门丰度最低，而放线菌门（Actinomycetota）和假单胞菌门（Pseudomonadota）的丰度相对较高。至窖池发酵末期，茅台产区的厚壁菌门丰度接近饱和，其他菌门生长受到强烈抑制。仁怀产区的细菌群落动态与茅台产区高度相似。在属水平上，所有产区在窖池发酵末期均以醋酸乳杆菌属（Acetilactobacillus）为主，其耐酸和耐乙醇特性与窖池环境高度兼容。金沙产区的喜盐菌属（Lentibacillus）和海洋杆菌属（Oceanobacillus）的丰度显著高于其他产区，这可能与当地特殊的生态环境有关。茅台产区在堆积初期，葡萄球菌属（Staphylococcus）和克氏菌属（Kroppenstedtia）占优势，这可能与茅台镇独特的高温堆积微环境有关。仁怀产区的细菌组成与茅台相似，但保留了更多的乳杆菌属（Lactobacillus）。醋酸乳杆菌属在窖池发酵阶段的绝对优势表明其在酱香型白酒酿造中通过调节乳酸代谢影响整体风味形成的关键作用。
3.4. 酒醅中显著差异细菌和真菌属的LEfSe分析
通过LEfSe分析，研究人员识别了不同产区的标志性微生物。对于真菌，金沙产区的标志菌属包括接合酵母属、威克汉姆酵母属（Wickerhamiella）、阿斯科菌属（Ascoidea）、伞菌属（Agaricus）等；茅台产区的标志真菌包括毕赤酵母属、嗜氢菌属（Hyphopichia）、迷孔菌属（Daedalea）等；仁怀产区显著差异的真菌有拟青霉属、红曲霉属、坎多尔菌属（Candolleomyces）等。对于细菌，金沙产区的标志菌属包括鞘氨醇菌属（Sphingobium）、果糖乳杆菌属（Fructilactobacillus）、热单胞菌属（Thermomonas）等；茅台产区的标志细菌包括乳杆菌属、林氏乳杆菌属（Limosilactobacillus）、醋酸杆菌属（Acetobacter）、慢生乳杆菌属（Lentilactobacillus）等；仁怀产区的细菌标志物仅有乳酸球菌属（Lactococcus）。这些细菌标志物的富集并非偶然，反映了支撑茅台风味特征的一个代谢协同菌群：乳杆菌属和林氏乳杆菌属作为主要乳酸生产者，直接贡献于“酸香”；其创造的酸性环境促进蛋白水解，释放游离氨基酸作为“酱香”化合物的关键前体；醋酸杆菌属进一步氧化乙醇为乙酸，不仅增加酸香，还是酯化反应的主要底物，产生乙酸乙酯等赋予果香和酯香。
3.5. 酒醅中挥发性风味代谢物分析
对三个产区所有样本的主成分分析（PCA）显示，茅台产区的样本离散度较大，而金沙和仁怀产区的样本离散度相对较小，表明茅台产区不同发酵阶段的代谢物差异显著。在所有酒醅样本中检测到500多种挥发性物质，包括酸、醇、醛、烃、有机氮化合物、有机杂环化合物、酯、醚、卤代烷、酮、萜类、酚酯、酚醚、酚和有机硫化合物等。酯类是主要的香气成分，在发酵过程中持续积累，其含量在茅台产区窖池发酵末期达到最高（2218.9 μg/kg），显著高于金沙（1521.17 μg/kg）和仁怀（1587.8 μg/kg），这一高酯特性与茅台的“醇厚酱香”风格一致。金沙产区堆积初期醛类（94.5 μg/kg）和酚类（67.58 μg/kg）含量在三大产区中最高，同时有机杂环化合物（87.59 μg/kg）也显著富集，这些物质可能是其“柔雅酱香”的风味基础。仁怀产区的代谢物分布呈现过渡性特征，物质含量介于金沙和茅台之间。对含量大于1 μg/kg的挥发性物质进行具体分析发现，金沙产区的苯乙醇（玫瑰香）含量普遍较高；而茅台和仁怀产区在窖池末期，苯乙酸乙酯（可可香）和丁二酸二乙酯（果香）含量显著增加。在酸类物质中，金沙产区堆积初期己酸（干酪味）含量较高，而在茅台和仁怀产区其含量显著降低。茅台产区窖池末期亚油酸乙酯和十六酸乙酯含量较高，对茅台酒的脂肪和蜡香风味有重要贡献。酚类物质如4-乙基愈创木酚在金沙产区的含量显著高于其他地区。总体而言，金沙产区的风味化合物在堆积初期更为丰富，而茅台和仁怀产区则在窖池发酵阶段酯类积累更为显著，这些差异共同造就了各产区的独特风格。
3.6. 不同产区酒醅间挥发性化合物差异分析
以茅台产区为参照，对仁怀产区、金沙产区与茅台产区进行代谢物差异分析。与茅台产区相比，仁怀产区有37种代谢物表达水平升高，95种降低；金沙产区有61种代谢物表达水平升高，121种降低。分别对MT vs RH和MT vs JS组进行OPLS-DA分析并绘制S-plot图，筛选VIP > 1且T检验P < 0.005的代谢物作为差异表达代谢物。置换检验证实模型未过拟合。在MT vs RH组中，反式-2-甲基-2-丁烯二酸二甲酯、4-氧代戊酸丁酯、3,4-二甲氧基甲苯等代谢物的VIP值接近3.0，对组间差异贡献显著。在MT vs JS组中，15种代谢物的VIP值超过2.0，其中1,2-二氯-4-甲基苯、己酸己酯、4-乙基-1,2-二甲氧基苯的VIP值高于3.0，对差异贡献极显著。
3.7. 各产区第四轮基酒中挥发性物质比较
三大产区第四轮基酒的主要挥发性物质分析表明，茅台产区的基酒酯类物质含量相对较高，例如乙酸乙酯和乳酸乙酯含量显著高于金沙和仁怀，赋予茅台酒更浓郁的水果香和甜香特征。金沙产区的基酒己酸乙酯和某些酸类物质含量相对较高，有助于其风味中的干酪和脂肪香气。仁怀产区的基酒乙缩醛含量相对较高，赋予其苹果般的香气。此外，异戊醇在茅台和仁怀产区的含量相近且高于金沙。金沙的糠醛含量极低，而茅台和仁怀含量较高，其焦糖香气为酒体增添了烘烤香。总体而言，三大产区基酒中酯、酸、醇的分布存在显著差异，这些差异直接影响成品酒的香气风格。
3.8. 不同产区基酒的感官评价
基于29种主要风味物质对第四轮各产区基酒进行主成分分析，前两个主成分的累积贡献率超过80%，结果显著，可将三大产区的基酒区分开。根据感官评价小组对七项感官特性的评价结果绘制雷达图显示，不同产区基酒的感官风味特征存在差异但也有相似之处。金沙产区的花香果香以及焦香更为突出；茅台产区的酸香和酱香更为显著；仁怀产区的感官特征基本介于金沙和茅台之间。为了进一步探究感官特性与关键风味物质的关系，采用偏最小二乘回归（PLSR）建立了感官特性与关键风味物质的相关性模型。结果显示，感官特性与风味物质主要分布在两个椭圆之间，表明它们之间存在强相关性。金沙产区位于第二象限，与花香果香、焦香、粮香呈强相关，同时与丁酸乙酯、异戊酸、苯乙醇、戊醇、乙醛等物质强相关。茅台产区位于第一象限，与酸香、曲香、酱香相关性良好，与乙酸、糠醛等强相关。仁怀产区位于第四象限，与三甲基吡嗪、己醇、乙酸乙酯强相关。不同感官特征的呈现与风味物质密切相关。
3.9. 酒醅微生物与挥发性物质及基酒风味的关联分析
冗余分析（RDA）揭示了优势真菌、优势细菌与酒醅挥发性物质之间的潜在关联，RDA1和RDA2轴分别解释了真菌66.7%和细菌78.3%的变异。苯乙醛、苯乙酸苯乙酯、苯乙酸乙酯与微生物群落结构分布高度相关，苯乙酸乙酯与正十六烷酸呈负相关。Mantel检验分析了酒醅挥发性物质与微生物群落的关系，发现挥发性物质对群落结构变化有一定影响。真菌群落与苯乙醛和正十六烷酸呈负相关，与苯乙酸乙酯、乙酸、丁二酸二乙酯呈正相关。细菌群落与苯乙酸苯乙酯和苯乙酸乙酯呈正相关。网络相关性分析进一步揭示了微生物与基酒风味物质的具体关系：酵母属（Saccharomyces）与乙酸乙酯呈显著正相关，与乙醛和己酸呈负相关，表明其对后者有抑制作用。毕赤酵母属（Pichia）与乙酸乙酯、糠醛、戊酸呈强正相关，突出了其对酯类和糠醛生成的贡献。哈萨克斯坦酵母属（Kazachstania）与己醇和三甲基吡嗪呈正相关，与异戊酸呈负相关，表明该菌株能促进己醇和三甲基吡嗪的产生并抑制异戊酸。丝状真菌如曲霉属（Aspergillus）和青霉属（Penicillium）普遍与辛酸呈负相关，表明它们能抑制辛酸的积累。拟青霉属（Paecilomyces）与乙缩醛（果香）呈强正相关，揭示了其在乙缩醛合成中的主导作用。总体而言，真菌通过协同或拮抗作用显著影响基酒风味物质的组成，尤其是酵母属、毕赤酵母属、哈萨克斯坦酵母属等酵母菌属在塑造果香、草香、烘烤香等关键风味特征中起关键作用，曲霉属则更多地参与抑制脂肪酸代谢。细菌方面，醋酸杆菌属（Acetobacter）与丙酸乙酯呈显著正相关。林氏乳杆菌属（Limosilactobacillus）与丁酸乙酯、异丁酸、辛酸呈强正相关，表明其在短链脂肪酸产生中的关键作用。林氏乳杆菌属与甲醇和三甲基吡嗪呈负相关，表明抑制其积累。海洋杆菌属（Oceanobacillus）与异戊酸呈显著正相关，链球菌属（Streptococcus）与苯乙醇呈负相关。此外，厌氧芽孢杆菌属（Anoxybacillus）与己酸呈正相关，与乙酸呈负相关，反映了其对脂肪酸代谢途径的差异性影响。酒醅中的细菌群落通过协同或拮抗作用调控基酒风味物质的组成，尤其是林氏乳杆菌属、醋酸杆菌属、海洋杆菌属等菌属在风味形成中起核心作用，其代谢活动直接关系到基酒的典型香气特征。
本研究通过多组学技术揭示了赤水河流域茅台镇、金沙和仁怀三大产区酱香型白酒的微生物群落结构、风味物质特征及其内在关联。研究发现，不同产区的微生物群落组成差异显著。其中，茅台镇产区以酵母和乳酸菌为主，酯类物质含量最高；金沙产区富含嗜冷真菌以及醛类和酚类物质；而仁怀产区则呈现过渡特征。这些差异直接塑造了各产区白酒的独特风格。进一步分析表明，酵母菌（如Saccharomyces）与酯类合成密切相关，而细菌（如Limosilactobacillus）则对短链脂肪酸代谢有显著影响。重要的是，这些功能角色嵌入于不同的群落组装过程中：金沙产区真菌组装的随机性促进了形成花香果香风味的代谢多样性基础，而茅台镇产区细菌组装的确定性则富集了专门的功能菌群，驱动了酸香和酱香前体的高效、靶向生产。这为微生物群落如何驱动区域风味形成提供了更深入的生态学和机制性理解。未来，可以进一步探索关键功能微生物的代谢途径，以实现风味的定向调控。该研究不仅阐明了酱香型白酒地域风格差异的微生物学基础，也为区域特色化生产和工艺优化提供了重要的理论依据，对推动中国白酒产业的科学发展具有重要意义。
