由Komagataella phaffii生产的蜂蜜松露甜蛋白的安全性评估

《Food and Chemical Toxicology》：Safety Evaluation of Honey Truffle Sweet Protein Produced from Komagataella phaffii

天然甜味蛋白Honey Truffle Sweet Protein（HTSP）通过Komagataella phaffii精准发酵制备，甜度达蔗糖的1000-2000倍。经细菌突变试验、哺乳动物细胞微核试验及13周啮齿类动物口服毒性研究，证实HTSP未显示基因毒性及毒性反应，其无可见不良反应剂量（NOAEL）为5400 mg/kg/day（相当于HT-AC 1500 mg/kg/day）。研究为HTSP作为非热量甜味剂在食品饮料中的应用提供安全依据。

　　

苏珊·M·波特（Susan M. Potter）|丹·赵（Dan Zhao）|阿什莉·罗伯茨（Ashley Roberts）|罗伯特·彼得森（Robert Peterson）|丹尼尔·E·康纳斯（Daniel E. Connors）|大卫·B·梅菲尔德（David B. Mayfield）|梅尔·劳埃德（Mel Lloyd）|托马斯·马丁（Thomas Martin）|萨比莎·帕皮内尼（Sabitha Papineni）|朱莉娅·托西（Giulia Tosi）

MycoTechnology公司，美国科罗拉多州奥罗拉市

摘要

蜂蜜松露（Mattirolomyces terfezioides）含有一种天然蛋白质，具有极强的甜味。这种蛋白质通过使用Komagataella phaffii（旧称Pichia pastoris）进行精准发酵生产，并被加工成喷雾干燥粉末，称为蜂蜜松露甜蛋白（HTSP）。该粉末中的总蛋白质含量至少为50%，其中至少50%为活性甜蛋白——蜂蜜松露活性成分（HT-AC）。根据食品/饮料的不同配方，HT-AC的甜度是蔗糖的1000-2000倍。为了评估HTSP作为食品和饮料甜味剂的安全性，进行了一系列遗传毒性试验和口服重复剂量研究。体外细菌突变试验和哺乳动物细胞微核试验的结果表明HTSP没有遗传毒性作用。在为期13周的口服暴露研究中，雄性和雌性Wistar Han大鼠分别接受了1800、3600和5400毫克/千克/天的HTSP剂量（相当于大约500、1000和1500毫克/千克/天的HT-AC）。实验过程中未出现死亡、与HTSP相关的不良临床病理现象、器官重量变化或宏观/微观观察异常。因此，未观察到不良效应的水平（NOAEL）为5400毫克/千克/天（相当于1500毫克/千克/天的HT-AC）。研究结果支持HTSP作为食品和饮料中膳食甜味剂的安全性。

引言

精制糖的过量摄入与多种不良健康后果有关，这促使全球卫生当局发布了旨在减少糖摄入量的饮食建议。例如，世界卫生组织（WHO）建议将游离糖的摄入量限制在总每日热量的10%以下，理想目标为5%以下，以获得额外的健康益处（世界卫生组织，2015年）。几十年来，人们一直在努力开发无热量甜味剂，由此产生了多种产品，从合成小分子化合物（如蔗糖醇、阿斯巴甜）到天然植物提取物（如罗汉果中的甜菊糖苷和莫格罗苷）。最近，一类新的甜味剂——甜蛋白——引起了广泛关注。这些蛋白质来源于各种植物和真菌，包括thaumatin、brazzein、monellin、mabinlin、pentadin、curculin和蜂蜜松露甜蛋白（Sun等人，2025年）。甜蛋白因其天然来源和通过精准发酵实现的可持续生产潜力而特别吸引人。蜂蜜松露（Mattirolomyces terfezioides）几个世纪以来一直被用于甜点中（Csorbainé等人，2009年），因其独特的甜味。这种天然蛋白质的甜度极高（根据食品或饮料的不同，其甜度是蔗糖的1000-2000倍），并天然存在于M. terfezioides中，这种真菌也被称为匈牙利甜松露或蜂蜜松露（McFarland等人，2024年；Sun等人，2025年）。MycoTechnology公司已经确定了赋予这种甜味的成分，并发现了编码这种蛋白质的完整DNA序列，该蛋白质由121个氨基酸组成。然而，随着松露的成熟，N端的甲硫氨酸残基在翻译后会被切割，从而形成成熟形式的蛋白质。MycoTechnology公司开发了一种利用Komagataella phaffii（旧称Pichia pastoris）进行精准发酵来商业化生产这种甜蛋白的方法。关于蜂蜜松露甜蛋白（HTSP）的分离和制备的详细信息，请参阅McFarland等人（2024年）的研究。

早期的HTSP安全性研究包括感官评估、计算机模拟和体外消化性研究以及计算机模拟致敏性研究（McFarland等人，2024年）。在感官剂量反应研究中，10-200微克/毫升的剂量范围相当于蔗糖溶液的1-10%的甜度。体外和计算机模拟消化测试均表明HTSP易于消化。计算机模拟比较显示，HTSP与已知过敏原的类似蛋白质和消化肽数据库（如AllerTop V2.0、Sort Aller、AlgPred 2.0）的结果表明HTSP很可能不是过敏原。此外，计算机模拟毒性预测（使用ToxinPred 2.0）也未发现与已知有毒肽的显著匹配。

根据欧洲食品安全局（EFSA）科学委员会的建议（EFSA，2012年），需要进行分阶段的毒性测试来评估食品添加剂的遗传毒性和重复剂量毒性。HTSP此前尚未作为天然甜味剂的安全性评估的一部分进行过毒理学测试。全球其他监管机构也要求采用这种安全性测试和评估新食品及饮料成分的方法。因此，根据EFSA（2012年）推荐的测试组合，并遵循良好实验室规范（GLP），进行了额外的研究。通过两种不同的体外测试（OECD 471细菌反向突变试验，2020年；OECD 487人类淋巴细胞微核试验，2023年）来评估HTSP的遗传毒性和重复剂量毒性。此外，还使用OECD 408（2018年）的13周重复剂量研究来评估HTSP的口服安全性。

测试项目和配方

通过使用K. phaffii进行精准发酵生产HTSP涉及两个主要过程，以确保产量和纯度。K. phaffi菌株已存档于德国微生物和细胞培养物收藏中心（GMbH，DSM# 35637），可通过联系相应作者获得非商业用途的材料转让协议。HTSP在K. phaffi中的制备、分离和放大过程已在McFarland等人（2024年）的研究中描述。

细菌反向突变试验

在体外细菌反向突变试验中，未观察到HTSP的浓度相关毒性（表3）。实验1和实验2中均未出现沉淀现象，所有阳性和阴性对照均被认定为有效。结果表明，在最高达5000微克/平板的浓度下，HTSP未在S. typhimurium菌株（TA98、TA100、TA1535和TA1537）或E. coli菌株（WP2 uvrA）中诱导突变（推荐的最大浓度）。

讨论

HTSP的安全性通过符合OECD和EFSA指南的分阶段毒理学方法进行了全面评估。体外细菌反向突变试验中未发现其具有突变活性，体外微核试验中也未观察到致畸或非整倍体效应，这些结果进一步证明了HTSP的非遗传毒性。所有测试浓度下均未出现细胞毒性或统计学上显著的微核形成。体内实验也支持了这一结论。

结论

研究表明，蜂蜜松露甜蛋白（HTSP）在体外和体内研究中均无遗传毒性和毒性。在大鼠中确定的未观察到不良效应的水平（NOAEL）为5400毫克/千克/天（相当于1500毫克/千克/天的HT-AC），这支持了其作为膳食甜味剂的安全性。这些发现为HTSP作为天然无热量糖替代品在食品和饮料中的监管考量和潜在商业应用提供了坚实的基础。

作者贡献声明

萨比莎·帕皮内尼（Sabitha Papineni）：撰写——审稿与编辑。朱莉娅·托西（Giulia Tosi）：研究。梅尔·劳埃德（Mel Lloyd）：研究。托马斯·马丁（Thomas Martin）：研究。大卫·梅菲尔德（David Mayfield）：撰写——初稿。罗伯特·彼得森（Robert Peterson）：研究。丹尼尔·E·康纳斯（Daniel E Connors）：研究。丹·赵（Dan Zhao）：研究。阿什莉·罗伯茨（Ashley Roberts）：研究。苏珊·M·波特（Susan M Potter）：研究

未引用参考文献

药品和医疗产品监管局，1999年；经济合作与发展组织，1998年；经合组织，2020年。

利益冲突声明

S. Potter、D. Zhao和D. Connors是MycoTechnology公司的全职员工，本研究由MycoTechnology公司资助。MycoTechnology公司雇佣A. Roberts和R. Peterson作为顾问。D. Mayfield和S. Papineni受雇于Labcorp Early Development Laboratories有限公司（Labcorp），并作为MycoTechnology公司的顾问。体外和体内毒性研究及支持性分析研究由Labcorp完成，由M. Lloyd、T. Martin和G.指导。

利益冲突声明

? 作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：S. Potter、D. Zhao和D. Connors是MycoTechnology公司的全职员工，本研究由MycoTechnology公司资助。MycoTechnology公司雇佣A. Roberts和R. Peterson作为顾问。D. Mayfield和S. Papineni受雇于Labcorp Early Development Laboratories有限公司（Labcorp），并作为MycoTechnology公司的顾问。

致谢

我们感谢MycoTechnology公司在研究材料的开发和生产方面的研发、分析和运营支持。