《Food Chemistry》：Antifungal mechanism and mycotoxin control of
Ligusticum jeholense essential oil against
Alternaria alternata in postharvest tomato
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辽东港芹精油通过优化酶促-深熔盐溶剂微波辅助提取法显著提升产率并保持化学一致性，其抗真菌活性（IC50 0.0718 μL/mL）可有效抑制 Alternaria alternata 引起的番茄采后病害，同时降低 alternariol 和 tenuazonic acid 毒素积累，机理涉及膜完整性破坏、能量代谢干扰及氧化应激。
王全水|庞森|童晓毅|罗杜强|王健|曹飞
河北大学药学院，河北省药品质量控制重点实验室，中国教育部药用化学与分子诊断重点实验室，保定071002，中国
摘要
链格孢菌（Alternaria alternata）会导致番茄严重的采后病害，威胁其保质期和食品安全。本研究采用辽西当归（Ligusticum jeholense）精油（LEO）开发了一种天然且环保的防治策略，该精油通过优化的酶辅助-深共晶溶剂微波辅助提取法（EDP–MAHD）提取，其产量比传统提取方法高出3.38倍。气相色谱-质谱（GC–MS）分析证实了不同生产批次间的化学成分一致性。体外实验表明，LEO对链格孢菌具有显著的抗真菌活性（IC??为0.0718 μL/mL），而体内实验则显示它能显著抑制病斑扩展并减少霉菌毒素链格孢醇（alternariol，AOH）和特努阿宗酸（tenuazonic acid，TeA）的积累。扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）、蛋白质组学及生理学分析表明，LEO破坏了真菌细胞膜完整性，干扰了能量代谢，并引发了氧化应激，表明其具有多靶点的抗真菌机制。小鼠急性毒性实验验证了其安全性。这些发现支持将LEO作为番茄采后病害和毒素控制的有效天然防腐剂。
引言
采后真菌病害长期以来对新鲜农产品的储存、运输和安全性构成了严重挑战（Hamad等，2023）。其中，链格孢菌尤为棘手，因为它会在番茄、辣椒及其他果蔬作物上引发黑腐病和凹陷病斑，显著降低采后品质（Schmey等，2024）。根据联合国粮食及农业组织（FAO的数据，全球从收获到零售阶段的食品损失平均约为13.2%，其中果蔬占比最高（FAO，2023）。从毒理学角度来看，链格孢菌在感染过程中会产生多种霉菌毒素。除了研究较为深入的链格孢醇（AOH）和特努阿宗酸（TeA）外，还发现了其他毒素，如链格孢醇单甲醚（AME）、altenuene（ALT）、altertoxins（ATX）和tentoxin（TEN）（Zhang等，2025）。由于这些毒素可能通过食物链对人体健康造成风险，它们受到了监管机构和研究人员的广泛关注，并被建议进行常规监测（Zhang等，2025）。选择AOH和TeA作为代表性链格孢菌毒素，是因为它们在食品中的检出频率较高且具有代表性，同时它们的生物合成途径不同，便于评估LEO对病害发展和毒素积累的影响（欧洲食品安全局，EFSA，2016）。具体而言，AOH是一种由非还原性PKS酶从乙酰辅酶A前体合成的多酮类毒素，而TeA则是由NRPS–PKS混合酶TAS1从L-异亮氨酸和乙酰衍生物（如乙酰乙酰辅酶A）合成的四元酸毒素（Wenderoth等，2019；Yun等，2015）。因此，这两种毒素的生物合成与乙酰辅酶A前体供应和细胞能量代谢密切相关。迫切需要开发天然、环保的抗真菌策略来减少采后腐烂和相关的霉菌毒素风险。
植物精油（EOs）因其天然来源、低毒性和多靶点生物活性而成为控制链格孢菌病害的潜在替代品（Feng等，2024；Liu等，2024）。然而，将EOs应用于番茄等复杂且敏感的食品基质仍面临挑战，主要源于两个未解决的问题：首先，精油的化学成分高度依赖于提取方法，导致不同研究间化合物类型和相对含量的显著差异，这阻碍了生物活性和机制结果的跨比较（Hou等，2022）；其次，病斑进展、病原体生长与链格孢菌毒素积累之间的关系尚未得到充分研究。大多数现有研究仅关注单一方面，要么是体外的抗真菌活性（St?elková等，2024），要么是体内的病斑发展（Salotti等，2024；Singh等，2024），未能在同一实验系统中同时量化病原体负荷和毒素含量。尽管已研究了植物精油的抗真菌机制，但很少有研究在综合框架内系统验证这些效果（Liang等，2024）。此外，关于链格孢菌对这些天然抗真菌剂的抗性潜力也研究较少（Wu等，2024）。
据推测，LEO通过破坏真菌的能量代谢、氧化还原平衡和细胞膜完整性来发挥抗真菌作用，从而抑制病害发展和链格孢菌毒素积累。辽西当归（Ligusticum jeholense）是一种属于伞形科的传统中药，其根茎和根部（高本）被收录在中国药典中，并广泛应用于临床实践和中药制剂中，说明其商业供应相对稳定（Li等，2022），且富含生物活性挥发化合物，尤其是单萜类、倍半萜类及其氧化衍生物，这些成分被认为是其生物活性的基础（Liu等，2024；Wei等，2022）。鉴于其成分特点和日益增长的天然防腐剂需求，辽西当归成为本研究的重点。此前本实验室的研究系统探讨了辽西当归精油的生物活性成分。分离并鉴定出一种代表性化合物(Z-ligustilide，并在果实模型中证明了其体外和体内的抗真菌活性。机制研究表明，(Z-ligustilide改变了线粒体能量代谢，增加了氧化应激，并导致细胞膜破裂，最终抑制了真菌生长并延缓了果实腐烂（Tong等，2025）。这些发现为本研究提供了明确的样本来源和成分基础，便于对LEO的抑制效果及其与链格孢菌毒素（AOH和TeA）的关系进行化学一致性评估。
因此，本研究旨在建立一条可验证的证据链，连接抗真菌活性、毒素抑制作用和机制基础。在避免过多工艺细节的情况下，确保了LEO的来源和化学成分的一致性，从而减少了批次间对生物结果的化学干扰。研究旨在回答两个相互关联的科学问题：LEO在体外和体内（包括番茄果实、离体叶片和幼苗）是否表现出稳定、可量化且剂量依赖的抗真菌活性？同时，它能否降低番茄中的AOH和TeA水平？此外，我们还探讨了抗真菌作用是否与能量代谢紊乱、氧化应激和细胞膜完整性破坏有关，并通过生理指标、超微结构证据（SEM/TEM）和基于DIA的蛋白质组学进行了验证。
为了解决这些问题并验证假设，本研究在化学控制条件下进行，逐步解决了关键问题。首先，优化了LEO的提取条件以提高批次间可比性和减少精油成分的变异性。其次，系统评估了LEO对链格孢菌的体外抗真菌活性，以确定定量效果基线。第三，在番茄果实、离体叶片和幼苗中验证了体内保护效果，并在同一实验框架内同步量化了病斑进展、真菌感染结果以及AOH/TeA的积累情况。同时进行了初步的安全性评估。总体而言，该设计建立了LEO成分、抗真菌效果、毒素缓解作用及其相关机制之间的综合证据链，为其在番茄采后病害和霉菌毒素控制中的应用提供了支持。
材料与试剂
辽西当归根茎购自中国河北的林氏圣泰药业有限公司（Linshi Shengtai Pharmaceutical Co., Ltd.），批次编号分别为：2009011229、2210011229、2303011229和2,306,011,229。所有批次均来自同一地理来源，分别采购于2022年9月10日、2023年4月28日、2023年9月7日和2023年10月27日。所有批次均以干燥根茎形式提供。提取前通过105°C烘干法测定水分含量，并计算精油产量
LEO提取及化学成分分析的优化
通过工艺优化显著提高了LEO的提取效率（图1A）。首先，通过单因素实验研究了酶类型、深共晶溶剂（DES）的水分含量和微波功率对提取产量的影响，随后使用Plackett–Burman设计（PBD）和Box–Behnken设计（BBD）进行了优化（Jadhav等，2023；图S1–S2，表S1–S5）。最终优化的方法称为EDP–MAHDLEO化学成分与其生物活性的关系
优化后的EDP–MAHD工艺显著提高了LEO的产量，同时在不同提取条件和原料批次中保持了其主要化学成分的相对稳定性（图1B–F和表S6）。与传统MAHD方法相比，EDP–MAHD方法将LEO产量从约0.89%提高到约3.01%，而关键化合物（如(Z-ligustilide和肉豆蔻素）的相对含量保持在±5%范围内结论
本研究表明，LEO在抗真菌和霉菌毒素控制方面具有巨大潜力，尤其是在抑制链格孢菌感染和减少采后番茄中的AOH和TeA毒素积累方面。在实验室规模下，优化的EDP–MAHD工艺提高了LEO产量，并保持了各批次主要成分的一致性，为在更现实的储存和分发条件下的应用评估提供了基础（例如
CRediT作者贡献声明
王全水：撰写——原始稿件，方法学设计。庞森：数据收集、概念化。童晓毅：数据可视化、概念化。罗杜强：数据收集。王健：撰写——审稿与编辑，监督。曹飞：撰写——审稿与编辑，监督，资金筹集，数据分析。未引用参考文献
Du等，2024
Du等，2024
欧洲食品安全局（EFSA）食品链污染物小组（CONTAM），2011
联合国粮食及农业组织（FAO），2023
刘等，2024
刘等，2024
刘等，2025
Locali-Pereira, Guazi, Conti-Silva和Nicoletti，2021
王等，2025
张等，刘和van der Fels-Klerx，2025
张等，2025
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文工作的已知财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了河北省自然科学基金（编号H2024201028）、河北大学科研创新团队（编号IT2023C1）、河北省教育委员会科研基金（编号CXZX2026040）以及河北大学优秀青年科研创新团队（编号QNTD202406）的资助。
