通过反胶束萃取法从白酒九窖中提取的普罗拉明（prolamin）的构象变化及其自组装特性受链长影响

《Food Chemistry》：Chain length-dependent conformational and self-assembly variations of prolamin from baijiu Jiuzao via reverse micelle extraction

本研究探讨表面活性剂链长对大曲酒糟中醇溶蛋白（PBJ）反胶束提取及其结构和聚集行为的影响。采用C12短链（DTAB）和C16长链（CTAB）表面活性剂，发现短链DTAB提取的PBJ具有更高含硫量（9.95%）、亲水（21.37%）和疏水（54.47%）残基比例，更强的氢键作用，更小的颗粒尺寸（180.4±5.2 nm）和扭曲皱褶片结构。通过圆二色光谱和牛血清白蛋白验证，表明短链表面活性剂通过纳米限域效应调控PBJ的氨基酸组成，增强分子间相互作用，促进结构有序化，最终调控聚集行为和微观形态。

　　

余婷婷|王芳|杨富荣|乔龙|胡楠|余晓琳|刘毅

四川科技学院化学工程学院，中国自贡学苑路180号，643000

摘要

本研究旨在探讨表面活性剂链长如何通过十二烷基三甲基溴化铵（DTAB，C₁₂，短链）和十六烷基三甲基溴化铵（CTAB，C₁₆，长链）反胶束来调节从白酒酒糟（PBJ）中提取的醇溶蛋白（prolamins）的结构。与CTAB提取的PBJ（PBJ-CTAB）相比，DTAB提取的PBJ（PBJ-DTAB）具有更高的半胱氨酸含量（9.95% vs 6.02%）、更高的亲水性（21.37% vs 16.98%）和疏水性（54.47% vs 53.55%）、更强的氢键作用、更小的聚集体尺寸（180.4 ± 5.2 nm vs 207.1 ± 8.4 nm），以及更复杂的片状结构（扭曲皱褶的片状结构而非尖锐边缘的片状结构）。圆二色性（CD）结果表明PBJ-DTAB中的α-螺旋/β-折叠含量更高，而无规则卷曲/β-转角含量更低，这一点通过牛血清白蛋白（BSA）得到了验证。这些结果表明，短链表面活性剂形成的反胶束较小，其纳米限制效应调节了提取PBJ的氨基酸组成。这种组成的改变增强了分子内相互作用（如疏水性、氢键和二硫键作用），促进了PBJ的结构有序化，最终调控了其聚集行为和微观形态。

引言

蛋白质依赖于精确的三维结构来维持其功能（Lesk, 2010; Sansom et al., 1997），其构象对环境变化非常敏感，包括与表面活性剂的相互作用。通过疏水相互作用和静电吸引，表面活性剂和蛋白质形成动态复合物，显著改变蛋白质的结构和稳定性（Guo et al., 2022; Otzen, 2011; Wang et al., 2021; Yan et al., 2024; Zhao, Liu, Zhang, & Zhu, 2019）。尽管水溶液中表面活性剂-蛋白质相互作用已被充分研究（Bhuiyan et al., 2024; Progga et al., 2023），但它们在有机溶剂中的行为仍知之甚少（有机溶剂常用于工业提取和催化）。这种差异源于一个根本性的区别：有机溶剂优先溶解非极性残基，这一过程会破坏蛋白质的天然结构，导致其展开，最终丧失功能（Timasheff, 1970）。这使得在这种非水环境中研究表面活性剂的作用变得复杂。

反胶束为这一挑战提供了解决方案。与传统的水胶束不同，反胶束在有机溶剂中形成，形成了一个由表面活性剂头基团包围的亲水水池，保护被包裹的蛋白质免受变性有机相的影响（Oh et al., 2022; Wan et al., 2016）。该系统通过两相过程实现蛋白质提取，可以从有机介质中回收蛋白质（Lin et al., 2017; Storm et al., 2014）。相比之下，传统的水胶束面临一个两难境地：将蛋白质包裹在疏水核心中会导致蛋白质失活，而无法有效包裹则使胶束无法作为研究平台。因此，反胶束系统提供了一个独特且可控的水-有机界面，使其成为研究表面活性剂-蛋白质相互作用如何影响有机介质中蛋白质结构的理想选择。

反胶束的结构和性质及其与被包裹蛋白质的相互作用可以精细调节。大量研究证实，表面活性剂在反胶束提取过程中会诱导蛋白质构象变化（Du et al., 2020; Qiu et al., 2023; Shiomori et al., 2000; Yu et al., 2017; Zhao et al., 2009; Zhao, Liu, Zhang, & Zhu, 2019; Zhao, Liu, Zhang, Zhu, & Ao, 2019）。重要的是，表面活性剂的烷基链长在这些相互作用中起着关键作用。对于具有相同头基团的阳离子表面活性剂，较短的链长会产生较小的反胶束（Sunaina Mehta et al., 2021），这减少了蛋白质与表面活性剂头基团之间的距离。这种空间接近性可以改变蛋白质-表面活性剂相互作用，例如蛋白质与表面活性剂头基团之间的静电相互作用，并可能驱动蛋白质构象转变（Shiomori et al., 2000）。然而，表面活性剂链长如何调节这些界面相互作用以驱动蛋白质结构重组的确切机制仍有待阐明。

虽然已有文献记录了反胶束在有机溶剂中对某些蛋白质结构的影响，但谷物醇溶蛋白代表了一个值得专门研究的独特类别。这些醇溶蛋白具有低水溶性和高酒精溶性（Huang et al., 2024; Tapia-Hernández et al., 2019），对有机介质具有天然的亲和力，使其特别适合作为研究表面活性剂-蛋白质相互作用如何调节非水环境中蛋白质结构和组装的模型系统。白酒酒糟是中国白酒生产的重要副产品，年产量约为4000万吨（Liu et al., 2022; Zhu et al., 2022），富含醇溶蛋白（PBJs），但这一资源尚未得到充分探索。尽管这一副产品具有巨大潜力，但关于表面活性剂链长如何影响反胶束提取过程中PBJ构象和组装的系统研究仍然不足。

本研究的主要目的是阐明表面活性剂烷基链长对在有机介质中通过反胶束系统提取的PBJ构象和组装的影响。为此，使用了两种阳离子表面活性剂：十二烷基三甲基溴化铵（DTAB，C₁₂）和十六烷基三甲基溴化铵（CTAB，C₁₆），它们的头基团相同但烷基链长不同。提取的PBJs（PBJ-DTAB和PBJ-CTAB）通过扫描电子显微镜（SEM）、动态光散射（DLS）、氨基酸分析、傅里叶变换红外（FT-IR）光谱和圆二色性（CD）光谱进行了表征，以确定其形态、聚集体大小、氨基酸组成和二级结构的变化。此外，在相同条件下还提取了牛血清白蛋白（BSA）作为参考蛋白，以验证表面活性剂链长对反胶束中蛋白质构象的一般影响。这项工作旨在建立表面活性剂链长与有机溶剂中蛋白质构象及组装行为之间的机制联系，为基础科学和农业副产品的价值利用提供见解。

材料与化学品

所有使用的化学品均为分析级，纯度≥99.9%（m/m），DTAB和CTAB的纯度为99%（m/m），购自Titan Scientific Co.（中国上海）。BSA（纯度≥98% m/m）购自Sangon Biotech Co., Ltd.（中国上海）。白酒酒糟来自当地的一家酿酒厂（中国四川宜宾）。实验过程中使用的是UPK-I-100 L纯水系统制备的去离子水。

PBJ网络的显微分析

使用SEM观察了用DTAB或CTAB反胶束提取的PBJ粉末的微观结构。图1展示了代表性的显微照片。

在较低放大倍数下（500 × 和 1000 ×；图1A、B、E、F），PBJ-DTAB和PBJ-CTAB均表现出多层片状结构，表明在反胶束提取和干燥后形成了复杂的片状蛋白质网络。这种聚集的片状形态与纳米颗粒形式不同。

结论

本研究表明，表面活性剂烷基链长精确调节了反胶束提取过程中PBJ的构象和组装。较短链长的DTAB形成的反胶束较小且限制作用更强，选择性地产生了富含疏水性残基、亲水性残基和半胱氨酸的PBJ-DTAB。这增强了分子内相互作用，使PBJ-DTAB采用更有序的二级结构，形成更紧凑的

CRediT作者贡献声明

余婷婷：撰写 – 原稿撰写、验证、方法学设计、数据分析、概念构建。王芳：数据可视化、研究分析、数据管理。杨富荣：数据可视化、研究分析、数据管理。乔龙：研究分析、数据管理。胡楠：方法学设计。余晓琳：撰写 – 审稿与编辑、监督。刘毅：撰写 – 审稿与编辑、项目管理。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了自贡市关键科学技术计划项目（2023-NKY-01-04）和四川省中医药管理局的传统中医药研究专项项目（2024MS186）的支持。