共培养的植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）产生的胞外多糖：结构特性及其在食品胶体应用中的遗传基础

《Food Hydrocolloids》：Exopolysaccharides from Co-cultured Lactiplantibacillus plantarum: Structural Properties and Genetic Basis for food hydrocolloid applications

分子量分布差异、热稳定性及流变学特性与基因簇结构相关联的共培养乳酸杆菌胞外多糖研究

　　

钱敏敏|梁琦|赵宝堂|程旭辉|张艳

甘肃农业大学食品科学与工程学院，功能性乳制品工程系，甘肃省实验室，兰州，730070，中国

摘要：

来自甘南藏族自治地区传统菌株L. plantarum CD11和MT35共培养物的胞外多糖（EPS）表现出良好的功能性。通过DEAE-52和Sephadex G-100色谱法分离出三种组分（EPS-a、EPS-b、EPS-c）。粗EPS含有半乳糖（6.39%）、葡萄糖（42.88%）、甘露糖（26.52%）、核糖（10.23%）和葡萄糖醛酸（13.98%），且分子量分布较窄（Mw/Mn = 2.810）。纯化的组分则表现出较宽的分子量分布（Mw/Mn：6.215–6.783）。刚果红实验显示，粗EPS和EPS-a中不存在三螺旋结构，而EPS-b和EPS-c具有不规则的构象。所有组分均具有较高的热稳定性（Td：241.16–329°C）。流变学研究表明，粗EPS和EPS-b可形成凝胶，而EPS-a和EPS-c表现为粘弹性固体（tanδ < 1，在3.98 rad/s以上）。基因组分析证实了EPS基因簇和糖转运基因的存在，进一步证明了其强大的生物合成能力。这些发现强调了它们作为食品胶体的潜力。这些EPS组分独特的流变特性和高热稳定性，尤其是能够形成凝胶的EPS-b和类似固体的EPS-c，为食品产品的质地设计提供了新的可能性。

引言

Lactiplantibacillus plantarum产生的胞外多糖（EPS）是一类具有多种生物活性和材料功能的天然生物大分子（Angelin, Kavitha, 2020）。由于其优异的物理化学性质，这些聚合物被广泛用作食品中的增稠剂、稳定剂和质地改良剂，同时也可作为药物载体和组织工程支架（Sun & Zhang, 2021）。与植物和藻类来源的多糖相比，细菌EPS在结构新颖性和耐加工条件方面具有明显优势。例如，乳酸菌产生的EPS可以提高细菌在胃肠道压力（如低pH值、胆盐和消化酶）下的存活率，从而促进肠道定植（Caggianiello, Kleerebezem, & Spano, 2016; London et al., 2014）。此外，细菌胞外多糖通过调节细菌与宿主之间的相互作用发挥作用，包括作为粘附因子促进益生菌与肠道黏膜的竞争性结合（Vélez, De Keersmaecker, & Vanderleyden, 2007; Vidhyalakshmi, Valli, Narendra Kumar, & Sunkar, 2016），调节免疫反应，并通过限制病原体粘附来维持肠道微生物群平衡（Dilna et al., 2015; Cano-Sarmiento et al., 2018）。例如，Lacticaseibacillus paracasei CIDCA8339和CIDCA83124单菌株培养物已被证明可以调节儿童肠道微生物群的组成，显著降低炎症标志物水平（Bengoa, Dardis, Gagliarini, Garrote, & Abraham, 2020）。某些Lactiplantibacillus产生的EPS在浓度为1000 μg/mL时对HepG2、A549和Vero细胞系具有剂量依赖性的抗癌活性，可抑制肝细胞癌细胞的增殖（Voběrková, Hermanová, Hrubanová, & Krzy?ánek, 2015）。然而，EPS的生物效应是双向的，其功能差异主要源于分子结构的多样性（Mende, Rohm, & Jaros, 2016），目前其组成关系尚未完全阐明，这严重限制了EPS的精准开发和应用。

作为典型的高分子量生物聚合物，Lactiplantibacillus产生的EPS分子量通常在10⁴至10⁶ Da之间，由通过糖苷键连接的单糖残基组成，形成线性或分支结构（Barcelos, Vespermann, Pelissari, & Molina, 2020）。其功能特性紧密依赖于结构特征，包括单糖组成、糖苷键类型、分支模式和电荷分布（Kristo, Miao, & Corredig, 2011; Mende et al., 2016）。然而，由于Lactiplantibacillus EPS的异质性、多分散性和溶液中的构象灵活性，其结构表征仍具有挑战性（Mende et al., 2016）。EPS的生物合成和结构完整性主要由染色体或质粒DNA上的特定基因簇中的遗传因素控制（Vandana & Das, 2022）。基因组学和合成生物学的最新进展使得能够对Lactiplantibacillus中的EPS合成基因簇进行功能分析，为定向调控多糖生产开辟了新途径。尽管单菌株发酵产生的EPS在结构和功能上往往较为有限，但L. plantarum的共培养方法通过代谢互作和调控相互作用，能够生成性能优异的EPS（Bader et al., 2020）。两种Lactiplantibacillus在共培养条件下的EPS含量增加及其不同的遗传特征促使我们关注由此产生的EPS。本研究系统地表征了这些共培养多糖的物理化学性质，并探讨了其结构特征与菌株特异性遗传差异（尤其是EPS合成基因簇）之间的关联。通过将基因组变异与聚合物结构和功能联系起来，本研究旨在为理解EPS的协同生产提供遗传基础，并支持功能性定制生物聚合物的合理设计。

本研究表征了L. plantarum CD11和L. plantarum MT35共培养产生的EPS的结构和功能特性。共培养显著提高了EPS含量，但其背后的机制尚需进一步阐明。分离出三种主要EPS组分，并结合各菌株的比较基因组数据进行了系统分析。结果直接将特定的结构修饰（如乙酰化和甲基化）与菌株特异性EPS合成基因簇中的相应遗传特征联系起来。糖苷键类型、分子量和高级结构的差异共同决定了各组分的物理化学特性，其中一种组分因三螺旋构象和高表面电荷而表现出显著的胶体稳定性。共培养产生的EPS的核心结构特征（如单糖组成和分子量范围）与个体基因组预测的生物合成潜力一致。这表明共培养主要通过代谢或调控机制增加了EPS产量，而非生成全新的聚合物类型。这些发现强调了EPS结构-功能关系在食品胶体科学中的重要性（Kumar et al., 2018; Maalej et al., 2014）。通过整合单菌株基因分型和共培养产物分析，本研究为设计用于目标食品胶体应用的微生物共培养提供了合理框架。

各菌株中EPS含量的测定

EPS含量采用酚-硫酸法测定。发酵液离心（8000×g，10分钟），然后用4%（w/v）的三氯乙酸在4°C下过夜沉淀上清液中的蛋白质。再次离心（12,000×g，15分钟），再用三倍体积的冷乙醇在4°C下沉淀上清液中的EPS，持续24小时。沉淀物通过离心（12,000 × g，30分钟）收集，重新溶解于蒸馏水中，并分析总碳水化合物含量。

各菌株中EPS含量的分析

本研究比较了L. plantarum CD11和L. plantarum MT35在单菌培养和共培养条件下的EPS产量。共培养系统产生的EPS含量为632 mg/L，比L. plantarum CD11高出约13.9%，比L. plantarum MT35高出22.2%（葡萄糖标准曲线：y = 0.9202x + 0.0085，R² = 0.9993）。较高的EPS产量为后续的物理化学性质分析提供了足够的材料。

讨论

不同乳酸菌产生的EPS具有不同的结构和功能特性，其结构对其在胶体系统中的技术性能至关重要（Mende et al., 2016; Y. Xu et al., 2019）。本研究从L. plantarum CD11和L. plantarum MT35的共培养物中纯化了三种中性杂多糖。这些多糖的单糖组成以半乳糖、葡萄糖、甘露糖和葡萄糖醛酸为主，与其生物合成潜力相匹配。

结论

本研究从L. plantarum CD11和L. plantarum MT35的共培养物中成功分离出三种新型甘露聚糖组分——EPS-a、EPS-b和EPS-c。尽管它们都以甘露糖为主链，但其精细结构存在显著差异。EPS-a的FT-IR光谱在1740 cm^-1处显示出吸收峰，表明存在乙酰化现象，其半乳糖与甘露糖的比例为0.26:1。NMR进一步显示其具有α-1,3和β-1,6糖苷键的分支结构。

CRediT作者贡献声明

赵宝堂：撰写、审稿与编辑、监督、资金获取。程旭辉：撰写、审稿与编辑、监督。张艳：监督、资金获取、概念构思。钱敏敏：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、验证、方法学设计、数据分析、概念构思。梁琦：初稿撰写、监督、资源提供、方法学设计、实验研究、资金获取、概念构思

未引用的参考文献

Agrawal, 1992; Angelin and Kavitha, 2020; Bader et al., 2010; Cano-Sarmiento et al., 2018; Chen et al., 2022; Das and Goyal, 2014; Ismail and Nampoothiri, 2014; Rehm, 2010; Vélez et al., 2007; Voběrková et al., 2016; Zhao and Liang, 2023.

利益冲突

作者声明本研究未涉及任何可能被视为利益冲突的商业或财务关系。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了中央引导型地方科学和技术发展基金项目（项目编号：25ZYJA038）以及关于发酵牦牛奶中益生菌和蛋白质衍生肽功能活性的研究项目（项目编号：0722093）的资助。