代谢工程改造益生菌E. coli Nissle 1917合成靛玉红

　　

摘要：

目的 靛玉红源于传统中药青黛，是一种具有广谱抗菌、抗炎及抗肿瘤活性的双吲哚环类天然活性成分，在临床主要被用于联合给药治疗慢性粒细胞白血病、银屑病等。探索利用安全的益生菌大肠杆菌Nissle 1917（EcN）为底盘，构建靛玉红的生物合成体系，以开发此中药材活性成分的绿色供应体系。 方法 基于EcN天然内源质粒的工程化改造，系统评估利用噬甲基菌Methylophaga sp. SK1来源的黄素单加氧酶fmo及其突变体（fmo^K223R 、fmo^K223R/D317S ），构建靛玉红合成途径的产物输出效率。结合代谢工程改造，敲除色氨酸合成途径的竞争性支路关键基因，包括苯丙氨酸合成关键基因pheA及酪氨酸合成关键基因tyrA；以此为基础，再行失活三羧酸循环的上游途径基因，包括丙酮酸激酶基因pykA和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc。最后，通过缺失色氨酸途径中的阻遏蛋白基因trpR，同时强化色氨酸途径中抗反馈抑制的trpE^S40F 等，进一步提升产物合成水平。 结果 经250 mL摇瓶（装液量50 mL）培养48 h显示，靛玉红产量达（176.9 ± 4.5）mg/L，相较于仅携带野生型fmo基因的亲本菌株提升约3.5倍，5 L发酵罐产量为（379.3 ± 12.3）mg/L。 结论 基于益生菌EcN内源质粒携带异源黄素单加氧酶突变体基因fmo^K223R，结合对色氨酸前体供应途径的代谢工程改造，获得的靛玉红产量达300 mg/L以上，展现出EcN作为细胞工厂生物合成传统中药活性成分的优良潜力。