《ACS Chemical Neuroscience》：4-Chlorobenzylamine Containing Maleic Acid Derivatives: Synthesis, In Silico Studies, and Anti-Alzheimer’s Activity
引言
神经退行性疾病是对大脑造成不可逆损伤的疾病，包括阿尔茨海默病（AD）、帕金森病、亨廷顿病等。AD是最常见的痴呆和记忆障碍病因，全球有超过5000万人受影响，预计到2050年患者数量将翻倍。由于人体在胎儿期后无法再生神经元，AD的治疗尤为困难。氧化应激和炎症介质是脑损伤的主要贡献者，过量产生的炎症介质和活性氧（ROS）会导致淀粉样β蛋白斑块和tau蛋白积累。此外，星形胶质细胞和小胶质细胞的过度活化会进一步增加ROS。关键炎症介质如环氧合酶-2（COX-2）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、核因子κB（NFκB）和Jun N末端激酶（JNK）在AD进展中起重要作用。除了炎症介质，乙酰胆碱水平降低或东莨菪碱等拮抗剂增加也会导致记忆障碍和痴呆。乙酰胆碱酯酶（ACE）抑制剂能有效对抗神经退行性变。
材料与方法
化学品与溶剂：使用的溶剂购自Sigma-Aldrich、Merck和Honeywell。二氯甲烷在使用前经氢化钙新鲜蒸馏。反应使用干燥玻璃器皿进行。使用的二氯甲烷、4-氯苄胺、马来酸酐、亚硫酰氯和三乙胺均为分析级。
4-((4-氯苄基)氨基)-4-氧代丁-2-烯酸的合成一般步骤：将等摩尔的4-氯苄胺和马来酸酐溶解在二氯甲烷中。混合物搅拌20分钟。通过薄层色谱（TLC）检查反应完成情况。反应完成后，通过过滤分离固体，并用甲醇进一步重结晶以获得更高纯度。
酰胺衍生物2(a–f)的合成一般步骤：将1 mmol的4-((4-氯苄基)氨基)-4-氧代丁-2-烯酸、1 mmol相应的胺和3 mmol的三乙胺加入二氯甲烷中，然后向反应混合物中加入1 mmol的亚硫酰氯（SOCl2）。混合物在室温下搅拌约1小时。反应完成后，通过TLC检查，用旋转蒸发器蒸发溶剂。所得残余物溶解在二氯甲烷中，先用1 N HCl洗涤，然后用1 N NaOH洗涤。分离有机层，用无水硫酸钠（Na2SO4）干燥并过滤。蒸发溶剂得到所需的酰胺衍生物2(a–f)。
纯化：通过重结晶纯化合成的化合物。使用以下溶剂系统进行薄层色谱检查合成和纯度：氯仿:甲醇（2:1），乙酸乙酯:石油醚（1:2）。使用Merck TLC硅胶F254预制板进行TLC。通过紫外灯（254 nm）观察斑点。
表征：使用Bruker ALPHA FTIR光谱仪与Eco ATR对新合成化合物进行表征；1H NMR和13C NMR使用Bruker AM300分光光度计记录，以氘代氯仿为溶剂。
动物：使用成年Sprague-Dawley大鼠，体重95-105克，饲养在22-25°C的受控温度下。提供12小时光照/黑暗循环。自由获取食物和水。动物随机分为组。一组用盐水处理，两组用测试化合物，一组参考（东莨菪碱），一组标准治疗组。使用AD模型进行行为研究，以研究合成化合物的抗阿尔茨海默病作用。动物研究按照实验动物资源研究所、生命科学委员会、大学和国家研究委员会的规定进行。
Y迷宫测试：Y迷宫测试用于测试空间工作记忆。Y迷宫是一个3臂水平迷宫，尺寸如下：长50厘米，宽10厘米，壁高20厘米。臂之间以120°等距分开。大鼠分为5组，每组5只。每组每天给药一次，持续4天。第一组作为阴性对照，腹腔注射生理盐水（10 mL/kg）。第二组作为疾病组，腹腔注射东莨菪碱（3 mg/kg）。而第三组和第四组（疾病+治疗），大鼠在测试前1小时腹腔注射10 mg/kg测试化合物，30分钟后通过腹腔注射东莨菪碱（3 mg/kg）诱导记忆损伤。第五组作为阳性对照，腹腔注射多奈哌齐（3 mg/kg）。Y迷宫的臂在每次测试后用5%乙醇彻底清洁以去除气味和废物。使用以下方程确定交替百分比：交替百分比 = [(交替次数) / (总臂进入次数 - 2)] × 100。
莫里斯水迷宫测试：在Y迷宫测试中分组的大鼠（n = 5）在第一天在没有平台的情况下接受60秒的游泳训练。在接下来的连续四天里，大鼠在游泳区域提供一个平台。一旦大鼠定位平台，允许其在平台上停留10秒，然后从池中移除。如果大鼠在120秒内无法定位平台，则将其放在平台上10秒，然后从池中移除。在最后一次训练试验后一天，每只大鼠单独进行探测试验，其中平台从池中移除。允许大鼠游泳120秒，并通过摄像机记录逃避潜伏期时间。逃避潜伏期时间减少显示抗阿尔茨海默病潜力。
苏木精-伊红（H&E）染色：H&E染色用于可视化组织病理学。在该染色技术中，首先制备组织切片并用二甲苯（100%）脱蜡，然后使用梯度乙醇系列（100%至70%）再水合，最后用蒸馏水洗涤。然后将制备的切片在苏木精中浸泡10分钟，在水中振荡5分钟，最后用1% HCl和1%氨水处理。然后将切片在伊红溶液中浸泡5-10分钟，用水冲洗并风干。干燥的切片使用梯度乙醇（70%、95%和100%）脱水并安装在玻璃盖玻片上。使用奥林巴斯光学显微镜拍摄图片，并分析图像进行组织学检查。
免疫组织化学分析：免疫组织化学染色与H&E染色相比略有修改。切片用二甲苯和梯度乙醇系列脱蜡，然后用蛋白酶K处理进行抗原修复，并用0.1 M磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤。应用4%过氧化氢（H2O2）甲醇溶液阻断过氧化物酶活性。一段时间后，用PBS洗涤切片，应用3-5%山羊血清，然后在0.1% Triton X-100和一抗中孵育整夜。一抗包括JNK、TNF-α、COX-2、NFκB和TRX（稀释1:100，Santa Cruz Biotechnology）。第二天，再次用0.1 M PBS洗涤切片，与生物素标记的二抗（稀释1:50）孵育，最后在湿盒中与ABC Elite kit（Santa Cruz Biotechnology）孵育1小时。再次用0.1 M PBS洗涤切片，在3,3'-二氨基联苯胺（DAB）溶液中染色，并使用梯度乙醇系列固定，随后用二甲苯处理，然后封片。使用光学显微镜拍摄免疫组织化学标记图像格式（TIFF）图像。使用图像软件通过优化图像的背景根据阈值强度并分析所有组在阈值强度下的阳性细胞来定量确定TNF-α和COX-2。强度表示为样品相对于盐水的相对积分密度。
合成马来酸衍生物的DPPH法自由基清除活性：自由基是破坏细胞功能的关键分子，尤其是在神经元中，阿尔茨海默病等神经退行性疾病的进展是体内自由基增加的结果。为了检查合成马来酸衍生物的抗氧化活性，进行了2,2-二苯基-1-苦基肼（DPPH）自由基清除测定。制备测试化学品和抗坏血酸（阳性对照）的1 mg/mL储备溶液，并使用连续稀释方法制备后续样品浓度（700、300、100、10、5和1 μg/mL）。使用甲醇制备1 mmol DPPH溶液。然后，从每个稀释液中取1 mL测试样品，将3 mL DPPH溶液放入单独的试管中，使每个试管体积达到4 mL。所有试管在室温下储存并用铝箔覆盖。如果测试化学品具有氧化潜力，DPPH的天然紫色将由于自由基清除活性而变为黄色。使用设置在517 nm的紫外分光光度计测量吸光度。使用以下公式计算自由基清除活性的抑制百分比：清除活性百分比 = [(对照吸光度 - 样品吸光度) / 对照吸光度] × 100。
乙酰胆碱酯酶（ACE）抑制测定：使用比色ACE筛选试剂盒在96孔板格式中进行实验。每种化合物的储备溶液在测定缓冲液中制备并连续稀释以获得20×工作浓度。从每种工作溶液中取10 μL转移至指定孔，然后加入酶、底物（乙酰硫代胆碱碘化物，ATChI）和显色试剂5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸，DTNB)。混合物在室温下孵育30分钟，并使用酶标仪在412 nm测量吸光度。多奈哌齐作为标准参考抑制剂，而含有酶和无抑制剂的缓冲液的对照孔用于确定基线活性。通过比较处理孔与对照来计算ACE抑制程度。
化学信息学：用于获取化学信息学的软件是Chem Sketch，并使用在线免费工具分析合成化合物的化学信息学。计算和报告的不同参数包括分子式、LogP值、氢键供体、极性表面积（PSA）、分子量和Lipinski规则验证。从核磁共振（NMR）假设的单分子结构在线上传，生成上述参数的输出。
分子对接：对所有分子针对特定蛋白质进行对接，并记录效果。使用免费许可软件进行分子对接研究。用于分子对接的计算机是HP笔记本电脑Intel CORE i5 vPro。使用化学信息学测量合成化合物的不同参数和化学信息学。使用Studio Visualizer v17.2.0.16349和AutoDock Tool v1.5.6软件查找配体和蛋白质相互作用及其结合亲和力。使用Auto Dock Vina 1.1进行分子对接。
靶蛋白制备：通过将马来酸衍生物（2a–2f）与COX-2、TNF-α、JNK和NFκB进行对接来进行对接研究。记录并比较配体和蛋白质的相对结合亲和力。蛋白质结构（PDB: 5FI9, 5MU8, 2G01, 和1SVC）分别从蛋白质数据库（PDB）站点下载。使用Discovery Studio通过去除水分子和杂原子制备配体分子，并获得具有极性氢的清洁分子。
配体制备：所有配体在Discovery Studio中单独以3D形式绘制并保存为PDB格式。然后使用AutoDock工具将配体保存为PDBQT格式以备对接。
对接分析和结合构象可视化：使用Pyrex软件选择网格盒。然后选择具有最佳结合能（kcal/mol）的最佳分子构象。使用Discovery Studio Visualizer可视化具有最低能量系数的结合构象。然后使用空间（3D）和线性（2D）相互作用图可视化和记录配体与蛋白质氨基酸的相互作用。
抗氧化潜力评估：谷胱甘肽（GSH）和谷胱甘肽-S-转移酶（GST）测定：通过使用先前描述的方法并稍作修改，测定谷胱甘肽（GSH）和谷胱甘肽-S-转移酶（GST）水平作为氧化应激的生物标志物。脑组织在磷酸盐缓冲液中匀浆并用苯甲基磺酰氟（PMSF）处理，然后离心。收集上清液，并使用5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)（DTNB）作为试剂定量GSH含量。15分钟后在412 nm测量吸光度，结果表示为μmol/mg蛋白质。对于GST活性，测定混合物由磷酸盐缓冲液（pH 6.5）、GSH和CDNB组成，向其中加入组织上清液。使用酶标仪在340 nm监测缀合物形成。所有测定进行三次，平均值从五个独立样品计算。
脂质过氧化测定：通过评估硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）作为氧化应激的标志，使用改进的比色程序评估脂质过氧化。简言之，将200 μL组织上清液与200 μL 100 mM抗坏血酸、580 μL 0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）和20 μL氯化铁溶液混合，混合物在37°C水浴中孵育1小时。通过加入1 mL 10%三氯乙酸（TCA）和1 mL 0.66%硫代巴比妥酸（TBA）终止反应，随后在沸水浴中孵育20分钟并在冰水中快速冷却。然后将样品离心10分钟，并在535 nm记录上清液的吸光度。脂质过氧化程度表示为每分钟每毫克蛋白质形成的丙二醛（MDA）纳摩尔数。
过氧化氢酶测定：使用先前报告的方案并稍作修改测定过氧化氢酶活性。简言之，将10 μL样品与290 μL 3%过氧化氢（H2O2）在每个孔中混合，并使用分光光度计在440 nm测量吸光度以监测H2O2的分解。
结果与讨论
马来酸衍生物使用所示的方案合成。通过TLC检查化合物的纯度，并通过1H NMR进行表征。合成化合物的纯化和重结晶完成，化合物1是无定形固体，化合物2a–2f是粘性半固体，颜色范围从浅黄色到棕色，化合物的产率范围从35%到85%。所有分子评估并满足Lipinski规则标准。进一步的化学信息学和物理性质在表1和表2中给出。
化合物1的FTIR光谱数据显示羧基C=O在1696 cm–1处的峰，这在化合物2(a–f)的FTIR光谱中缺失。从这些数据中，化合物2(a–f)中酰胺键的形成非常明显。在化合物1中，两个CH2质子的单重峰在4.5 ppm观察到。两个-CH质子的双峰在6.95和6.10 ppm观察到。芳基的四个质子作为两个双峰在7.35和7.56 ppm共振。酰胺基团的另一个单重峰在9.73 ppm共振。
化合物2a显示苄基CH2的四个质子的单重峰在3.61 ppm。CH的一个质子的双重峰在6.97 ppm存在，而CH的另一个质子的双重峰在7.10 ppm显示。苯基部分的五个质子的多重峰在7.26–7.35 ppm范围内观察到。两个苯基质子的一个双重峰在7.35 ppm观察到，而另外两个质子的双重峰在7.56 ppm出现。酰胺质子的单重峰在9.73 ppm观察到。
化合物2b显示CH2的两个质子的单重峰在3.62 ppm。CH的两个质子的双重峰在6.96和7.12 ppm显示。四个苯基质子的多重峰在7.50–7.71 ppm范围内观察到。两个芳基-H的两个双重峰在7.30和7.51 ppm出现。酰胺基团的单个质子的单重峰在9.33 ppm共振。
在化合物2c中，吗啉基团的八个质子的多重峰在3.33–3.52 ppm范围内观察到。苄基CH2质子的单重峰在3.61 ppm出现。对应于烯烃CH质子的两个双重峰分别在6.67和7.14 ppm共振。芳基的两个质子的双重峰在7.35 ppm存在，而另外两个芳基质子的双重峰在7.56 ppm出现。酰胺质子的单重峰在9.36 ppm显示。
在化合物2d中，环己基的十个质子的多重峰在1.11–1.74 ppm范围内观察到。CH质子的多重峰在4.54 ppm观察到。CH2的两个质子的单重峰在3.65 ppm观察到。CH的两个质子的两个双重峰在6.66和7.2 ppm出现。苯基的两个质子的两个单重峰在7.32和7.55 ppm观察到。酰胺基团的两个质子的单重峰在9.36 ppm观察到。
在化合物2e中，CH2的两个质子的单重峰在4.2 ppm观察到。CH的两个质子的双重峰在6.62 ppm出现，而其他CH质子的双重峰在7.1 ppm共振。八个苯基H的多重峰在7.2–7.45 ppm范围内显示。酰胺基团的一个质子的单重峰在11.48 ppm共振。
在化合物2f中，甲氧基的3个质子的单重峰在3.8 ppm观察到。CH2基团的两个质子的单重峰在4.35 ppm显示。CH的两个质子的双重峰在6.17和7.41 ppm共振。芳基的8个质子的多重峰在6.90–7 ppm范围内共振。酰胺质子的单重峰在9.36 ppm出现。
Y迷宫测试：对选定的合成酰胺衍生物（2a, 2f）进行Y迷宫测试，通过使用%自发交替检查空间记忆。两种化合物均显示%交替增加。在第1、2、3和4天，盐水（10 mL/kg）组的%交替分别为73 ± 0.64、71 ± 0.83、70 ± 0.75和72 ± 0.51。东莨菪碱组在第1、2、3和4天（3 mg/kg）的%交替分别为62 ± 0.81、60 ± 0.63、58 ± 1.12和55 ± 1.51。东莨菪碱+2a（10 mg/kg）组在第1、2、3和4天的%交替分别为68 ± 0.52、65 ± 0.64、60 ± 0.63和61 ± 0.25。东莨菪碱+2f（10 mg/kg）组在第1、2、3和4天的%交替分别为65 ± 0.36、63 ± 0.43、60 ± 0.25和58 ± 0.60。东莨菪碱（3 mg/kg）+多奈哌齐（3 mg/kg）组在第1、2、3和4天的%交替分别为70 ± 0.63、68 ± 0.85、66 ± 0.42和64 ± 0.67。
莫里斯水迷宫测试：进行莫里斯水迷宫测试以评估大鼠在第1、2、3和4天的逃避潜伏期时间。观察到的逃避潜伏期时间如图所示。对于盐水（10 mL/kg）组，值分别为19 ± 0.62、17 ± 0.89、18 ± 0.74和16 ± 0.57。给予东莨菪碱（3 mg/kg）的大鼠在第1、2、3和4天的潜伏期时间分别为25 ± 0.56、22 ± 1.50、26 ± 0.98和25 ± 1.20。东莨菪碱+化合物2a（10 mg/kg）在第1、2、3和4天的潜伏期时间分别为18 ± 0.90、20 ± 0.79、21 ± 1.10和20 ± 0.80。东莨菪碱+化合物2f（10 mg/kg）在第1、2、3和4天的潜伏期时间分别为20 ± 0.60、22 ± 0.65、22 ± 0.90和21 ± 1.50。东莨菪碱+多奈哌齐（3 mg/kg）在第1、2、3和4天的潜伏期时间分别为20 ± 1.20、18 ± 0.90、21 ± 0.65和18 ± 1.5。
DPPH测定的自由基清除活性：合成的化合物与作为标准的抗坏血酸相比显示出显著的可比抗氧化或自由基清除活性。显示抗氧化活性的化合物按降序排列为：抗坏血酸 < 化合物2f < 化合物2e < 化合物2a < 化合物2c < 化合物2d < 化合物2b。
乙酰胆碱酯酶（ACE）抑制测定：在抗氧化和分子对接研究之后，进一步评估化合物2a和2f对ACE的抑制作用。与标准药物多奈哌齐相比，评估化合物2a和2f对ACE的抑制作用。两种测试化合物均显示对酶的浓度依赖性抑制，化合物2a在所有测试浓度下显示最显著的活性。相比之下，化合物2f显示中等抑制，在降低的浓度下明显低于2a。在筛选的分子中，化合物2a作为最有效的抑制剂出现，反映了与对接和抗氧化结果的强相关性。这些发现表明化合物2a作为进一步开发ACE抑制剂的有前途的先导支架。ACE的结果在表3中给出。
免疫组织化学分析：在免疫组织化学分析中，海马和皮层区域是阿尔茨海默病中大脑最受影响的区域，与盐水组相比，东莨菪碱（疾病）组中COX-2、TNF-α、JNK和NFκB的过度表达非常明显。所有测试的化合物与疾病组相比均显示炎症标志物表达的显著降低。在测量COX-2反应时，观察到疾病组中COX-2的相对积分密度为0.625 ± 0.213，标准组为3.332 ± 0.265，2a组为2.337 ± 0.48，2f组为3.54 ± 0.52。TNF-α的表达在疾病组中过量观察到为6.661 ± 0.64，在标准组中为3.76 ± 0.24。在化合物2a组中，为3.979 ± 0.57。在化合物2f中，为2.557 ± 0.34。疾病组中JNK的表达为5.48 ± 0.76，标准组中为3.24 ± 0.36。在化合物2a中，为2.92 ± 0.55。在化合物2f中，为2.59 ± 0.45。疾病组中NFκB的表达为5.62 ± 0.43，标准组中为2.32 ± 0.38，化合物2a中为2.05 ± 0.38，化合物2f中为2.12 ± 0.43。
苏木精和伊红染色：苏木精和伊红染色用于评估大脑组织在皮层区域。海马和皮层区域是阿尔茨海默病中大脑最受影响的区域。结果显示，用生理盐水（10 mL/kg）处理的大鼠，脑组织的细胞结构完整，组织的正常外观明显，而给予东莨菪碱（3 mg/kg）的疾病组显示异常的细胞形态。细胞结构被破坏，显示皮层区域损伤，这导致大脑功能异常。标准治疗组多奈哌齐（3 mg/kg）以及测试化合物2a（10 mg/kg）和2f（10 mg/kg）治疗显示脑组织细胞结构的显著改善。这表明标准和治疗化合物具有相似的神经保护功能，从切片中非常明显。
分子对接：配体与靶蛋白COX-2（PDB-ID 5F19）、TNFα（PDB-ID 5MU8）、JNK（PDB-ID 2G01）、NFκB（PDB-ID 1SVC）、GSK-3β（PDB-ID
