《PAIN》：Optimizing engagement in digital behavioral interventions for chronic pain: challenges and opportunities
1. 引言
外周敏化，以背根神经节（DRG）神经元兴奋性增加为特征，在膀胱过度活动症（OAB）和间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征（IC/BPS）相关慢性盆腔疼痛的病理生理学中起关键作用。目前临床上通过膀胱内灌注利多卡因或膀胱注射A型肉毒毒素来抑制膀胱感觉传入神经的高敏感性，虽能有效缓解疼痛和OAB症状，但这些方法可能同时损害膀胱运动功能，导致尿潴留。因此，靶向抑制膀胱感觉传入神经为治疗OAB和慢性膀胱疼痛提供了更有前景的策略。
化学遗传学能够与激动剂结合精确调控神经活动，其中基于修饰毒蕈碱受体的设计药物激活受体（DREADDs）应用最广。DREADDs技术在中枢神经系统应用广泛，但在外周神经系统应用有限。然而，近期研究通过该技术特异性靶向DRG神经元或三叉神经节神经元，已在多种慢性疼痛模型中成功抑制疼痛行为。
腺相关病毒（AAVs）因其相对安全性和长期有效性，成为化学遗传学技术的常用递送载体。AAV9在鞘内或全身注射时能有效转导DRG神经元。源自AAV9的AAV-PHP.S据报道比AAV9更有效地转导外周神经元，并能高效转导DRG神经元。经过工程化改造用于逆行转导的腺相关病毒-retro（AAV-retro）表现出独特的可靠长距离逆行运输能力，能从末梢前轴突和突触逆行至神经元胞体，其逆行访问投射神经元的效率可与经典逆行标记试剂相媲美。AAV-retro最近已被用于转导小鼠结节状神经节中的外周感觉神经元以及小鼠和大鼠的DRG神经元。
在DRG神经元转导途径方面，AAV的全身应用因在中枢神经系统和外周器官中广泛转导而缺乏特异性。直接注射到DRG虽更有效但具有侵入性，技术复杂，临床转化价值较低。鞘内注射在临床上是可行的，但对特定靶点缺乏特异性。器官内注射，如结肠内或关节内注射，已被证明在转导支配靶器官的DRG神经元方面更具特异性。此外，膀胱注射药物（如A型肉毒毒素）在泌尿科实践中很常见。
为促进化学遗传学方法在治疗下尿路功能障碍方面的临床转化，本研究从三种AAV血清型（AAV9、PHP.S和AAV-retro）和两种临床可行的注射途径（膀胱注射或鞘内注射）中筛选出最优的AAV-retro和膀胱注射途径。随后，利用该途径将抑制性DREADD——hM4D(Gi）递送至膀胱DRG神经元。激活hM4D(Gi）后，在体外有效抑制了膀胱DRG神经元的兴奋性，在体内显著缓解了急性和慢性疼痛模型中的OAB和疼痛行为。
2. 方法
实验动物为6至8周龄雌性C57品系小鼠。选择雌性小鼠的主要原因是IC/BPS在女性患者中比男性更常见。所有动物程序均符合山东大学动物保护与使用委员会的规定。
实验使用的表达荧光报告基因ZsGreen的病毒购自汉恒生物，包括AAV-retro-CMV-ZsGreen、AAV9-CMV-ZsGreen和AAV-PHP.S-CMV-ZsGreen。用于病毒注射时，所有病毒稀释至三种滴度。此外，AAV-retro-hSyn-mCherry-WPRE和AAV-retro-hSyn-hM4D(Gi)-mCherry-WPRE购自上海和元生物，使用滴度为1×1013vg/mL。
膀胱注射AAV或DiI在异氟烷麻醉下进行，于膀胱壁5个注射点注射病毒溶液或DiI染料。鞘内注射参照先前描述的方法进行，将病毒溶液注射至腰椎蛛网膜下腔靶向L6和S1 DRG。
组织制备和免疫荧光方面，小鼠经心脏灌注后取组织，固定、脱水、OCT包埋后进行冰冻切片。切片经封闭、一抗孵育、二抗孵育后封片，于荧光显微镜下成像，使用ImageJ进行荧光信号定量。
DRG神经元培养方面，取L6–S1 DRG，酶消化后机械分离，重悬于无血清培养基中，铺于多聚赖氨酸包被的盖玻片上，孵育后进行钙成像。
钙成像实验参照先前研究进行，神经元负载Fura 2-AM，于显微镜下记录340 nm和380 nm激发光下的荧光发射，计算比率变化，比率变化大于0.1视为有反应。
排尿点斑实验将小鼠置于铁丝网笼中，适应后置于滤纸上收集尿液4小时，于紫外灯下观察并量化大小尿斑点数量、总面积等参数。
膀胱测压记录在乌拉坦麻醉下进行，将PE-50导管插入膀胱并连接至注射泵，以恒定速率灌注生理盐水，通过压力传感器记录膀胱内压，记录收缩间隔、排尿压力阈值、峰值排尿压力和排尿后残余尿量等参数。
Von Frey测试用于评估腹部机械敏感性，将不同力度的Von Frey细丝应用于膀胱投影区域的下腹部，记录退缩反应，计算反应频率和阈值。
自发痛评估记录15分钟内小鼠舔舐（指向下腹部）和冻结（不动姿势，头朝向下腹部）行为次数。
旷场测试在安静、温度控制的环境中进行，将小鼠置于方形场地中心，自由探索5分钟，视频记录运动轨迹，分析总运动距离等指标。
数据以均值±标准差表示，采用非配对t检验或双因素重复测量方差分析等进行统计，P < 0.05认为有显著差异。
3. 结果
3.1. 膀胱注射AAV9或AAV-retro成功转导L6–S1背根神经节神经元
首先观察膀胱注射三种AAV血清型（AAV9、AAV-retro、AAV-PHP.S）对小鼠膀胱支配神经元L6–S1 DRG的转导效率。结果显示，膀胱注射AAV9或AAV-retro能成功转导L6–S1 DRG神经元，而对照组无荧光。转导效率与病毒滴度相关，在1×1013vg/mL时最高，AAV9转导约20%的L6–S1 DRG神经元，AAV-retro转导约10%。转导效率在注射后4-8周内与时间无关。意外的是，膀胱注射AAV-PHP.S未能转导L6–S1 DRG神经元，但尾静脉注射可有效转导L4 DRG神经元，表明并非病毒活性丧失。此外，膀胱注射AAV9或AAV-retro也能转导同样支配膀胱的T13–L1 DRG神经元，但AAV-retro在T13–L1 DRG的转导比例相对较低。
3.2. 膀胱注射AAV-retro比AAV9对膀胱背根神经节神经元具有更高的转导特异性
特异性转导膀胱DRG神经元对于最小化副作用至关重要。通过膀胱注射DiI标记膀胱特异性DRG神经元后评估转导效率，发现AAV9和AAV-retro在DiI阳性神经元中的转导效率相似，均约为70%。但AAV9转导了更多DiI阴性的DRG神经元，特异性较低。进一步检查不支配膀胱的L2–L5 DRG，发现AAV9转导了3%-9%的神经元，而AAV-retro未检测到转导。此外，AAV9在肝、心、脑等高血管化器官中有转导，而AAV-retro在这些组织中未转导细胞。这些结果表明膀胱注射AAV-retro对膀胱DRG神经元的转导特异性高于AAV9。除胞体外，膀胱注射的AAV-retro还转导了膀胱壁中的外周神经末梢和脊髓浅背角及背连合中的中枢神经末梢，这些是感觉神经的主要投射区。未发现AAV-retro转导主要盆腔神经节中的自主神经元和脊髓中的运动神经元。
3.3. 膀胱注射比鞘内应用AAV-retro对膀胱背根神经节神经元具有更高的转导特异性
鞘内注射在动物研究和临床实践中均可行。比较膀胱注射与鞘内注射AAV-retro的转导特异性，发现膀胱注射AAV-retro在DiI标记的DRG神经元中的效率（AAV+DiI+占全部DiI+神经元的比例）和特异性（AAV+DiI+占全部AAV+神经元的比例）均高于鞘内注射。鞘内注射AAV-retro非特异性地转导了不支配膀胱的L2–L5 DRG神经元，也证明了其较低的特异性。
3.4. 膀胱注射AAV-retro转导的背根神经节神经元类型
使用包装有荧光报告基因mCherry的AAV-retro进一步分析转导的神经元类型。按胞体直径分类，小直径、中等直径和大直径神经元分别占转导神经元的40.85%、30.99%和28.17%。使用伤害性神经元标记物TRPV1、小肽能神经元标记物CGRP、非髓鞘非肽能神经元标记物IB4和大髓鞘神经元标记物NF200进行标记，发现AAV-retro转导了TRPV1阳性、CGRP阳性、IB4阳性和NF200阳性神经元中的60%、18%、30%和42%。
3.5. 膀胱注射AAV-retro-hSyn-hM4D(Gi）降低膀胱感觉神经元的兴奋性
利用AAV-retro将抑制性DREADD（hM4D(Gi））特异性递送至膀胱感觉神经元。构建AAV-retro-hSyn-hM4D(Gi)-mCherry，膀胱注射后检测其转导效率和对DRG神经元的功能抑制效果。发现AAV-retro-Gi在L6–S1 DRG神经元中的转导效率与AAV-retro-CMV-ZsGreen相当。钙成像实验显示，用CNO激活AAV-retro-Gi可显著抑制转导神经元对高钾、辣椒素和Piezo1激动剂Yoda1等刺激引起的细胞内钙离子升高反应，但对未转导神经元无影响。值得注意的是，CNO的抑制作用在冲洗15分钟后仍持续存在，表明hM4D(Gi）激活后在L6–S1 DRG神经元中产生了持续的神经元兴奋性抑制。
3.6. 激活AAV-retro-hM4D(Gi）抑制正常小鼠的排尿频率并降低下腹部机械敏感性，但不影响排尿压力和运动功能
在正常小鼠中研究AAV-retro-Gi激活对排尿行为和下腹部机械敏感性的影响。膀胱注射AAV-retro-hM4D(Gi)-mCherry或对照病毒AAV-retro-mCherry，注射后7-8周进行行为学评估。腹腔注射CNO激活hM4D(Gi）后1小时进行测试，24小时后再次评估以观察CNO的冲洗效应。
排尿点斑实验显示，Gi激活后总排尿面积无显著变化，但每次排尿的平均面积增加，大尿斑点数无显著变化，小尿斑点数减少，总尿斑点数减少，大斑点平均面积增加。且观察到CNO效应的冲洗现象，CNO对对照组小鼠无影响。
膀胱测压记录显示，CNO应用后1小时，排尿间隔延长，排尿压力阈值增加，但峰值排尿压力和排尿后残余尿量未受影响。CNO对对照组小鼠无影响。
Von Frey测试显示，Gi激活降低了小鼠下腹部对Von Frey刺激的反应频率，提高了退缩阈值。
旷场测试评估运动功能，为避免环境熟悉度偏差，对不同组小鼠进行测试。Gi激活未改变总运动距离，表明运动功能未受影响。
3.7. 激活AAV-retro-hM4D(Gi）抑制辣椒素膀胱内灌注诱导的膀胱过度活动和伤害感受
评估AAV-retro介导的hM4D(Gi）在治疗OAB和膀胱疼痛方面的治疗价值，采用辣椒素膀胱内灌注诱导的急性膀胱疼痛模型。小鼠分为三组：膀胱内灌注生理盐水+腹腔注射生理盐水、膀胱内灌注辣椒素+腹腔注射生理盐水、膀胱内灌注辣椒素+腹腔注射CNO。
排尿点斑实验显示，辣椒素灌注立即引发OAB样行为，包括总排尿面积减少、每次排尿平均面积减少、大尿斑点数减少、小尿斑点数增加、总尿斑点数增加、大斑点平均面积减少。这些症状在表达hMD4D(Gi）的小鼠中被Gi激活显著缓解，而CNO对对照组小鼠的辣椒素诱导反应无影响。
辣椒素灌注立即引发伤害性反应，表现为冻结事件增加。辣椒素未增加舔舐行为，CNO对两组小鼠的该指标均无影响。自发痛行为也可通过旷场测试中总运动距离减少来反映。Gi激活显著改善了Gi小鼠的自发痛行为，CNO对对照组小鼠无影响。
辣椒素灌注还增强了下腹部的机械敏感性，表现为对Von Frey刺激的反应频率增加和阈值降低。这些诱发性疼痛行为在Gi小鼠中被Gi激活改善，CNO对对照组小鼠无影响。
3.8. 激活AAV-retro-hM4D(Gi）改善环磷酰胺诱导的膀胱疼痛模型小鼠的膀胱过度活动和慢性疼痛
进一步评估hM4D(Gi）激活在慢性OAB和膀胱疼痛模型中的治疗价值，该模型通过重复腹腔注射环磷酰胺建立。
排尿点斑实验显示，CYP诱导了显著的OAB表现，包括总排尿面积减少、每次排尿平均面积减少、大尿斑点数减少、小尿斑点数增加、总尿斑点数增加。Gi激活显著改善了这些排尿功能障碍。CNO对对照组小鼠无影响。
Gi激活还显著改善了自发痛行为，表现为冻结事件减少。与急性疼痛模型类似，CYP小鼠未表现出舔舐事件增加，CNO无影响。Gi激活显著改善了CYP小鼠的机械刺激诱发的疼痛行为（对Von Frey细丝的反应频率增加和阈值降低）。CNO对对照组小鼠无影响。
4. 讨论
本研究证明膀胱注射AAV-retro可特异性转导小鼠膀胱感觉神经元。利用AAV-retro介导的hM4D(Gi），有效抑制了膀胱DRG神经元，显著缓解了OAB和膀胱疼痛行为。这些发现表明膀胱注射AAV-retro介导的hM4D(Gi）在治疗OAB和慢性膀胱疼痛方面具有转化前景。
本研究主要目的是检验AAV介导的化学遗传学在治疗下尿路症状方面的转化价值。因此，在选择AAV递送途径和血清型时，转导膀胱DRG神经元的特异性是主要考虑因素。全身递送可能导致更多的脱靶转导效应。直接DRG注射技术难度大，在临床环境中不可行。因此，本研究排除了这两种途径。
与鞘内注射相比，膀胱注射在泌尿科实践中相对更可行。研究发现膀胱注射AAV9或AAV-retro能有效转导支配小鼠膀胱的L6–S1和T13–L1 DRG神经元。值得注意的是，与AAV9相比，AAV-retro表现出更高的特异性，AAV9还转导了支配其他器官的L2–L5 DRG神经元以及其他器官。这种较低的特异性可能是由于AAV9进入了体循环。
尽管AAV-PHP.S是为外周神经元设计的，但膀胱注射AAV-PHP.S未能转导L6–S1 DRG神经元。这一意外结果可能源于其无法进行逆行轴突转导，但并非生物活性丧失，因为尾静脉全身应用AAV-PHP.S可有效转导L4 DRG神经元。
尽管鞘内注射在临床上也可行，但研究发现鞘内递送AAV-retro的特异性较低，因为它转导了L2–L5 DRG神经元。因此，膀胱注射AAV-retro介导的化学遗传学被确定为特异性控制膀胱DRG神经元的最佳方法。
膀胱注射AAV-retro有效转导了支配膀胱的L6–S1和T13–L1 DRG神经元，转导率分别为10%和3%，与这些DRG中膀胱神经元比例的报告一致。膀胱递送AAV-retro更高特异性的证据还包括：转导了60%-70%的DiI标记膀胱DRG神经元；未转导支配其他器官的L2–L5 DRG神经元；未转导膀胱外器官；转导了膀胱感觉神经元，包括膀胱中的神经末梢、DRG胞体和脊髓中的感觉神经中枢末梢；未转导逼尿肌；未转导脊髓中的运动神经元；未转导盆腔神经节中的自主神经元。AAV-retro相对于AAV9的更高特异性与先前报告一致，表明AAV-retro可用于选择性器官特异性靶向DRG神经元。
除转导DRG神经元外，有报道称在大鼠中全身递送或小鼠肌肉内给予AAV-retro可转导脊髓中的运动神经元和盆腔神经节中的交感神经元。本研究中，当通过膀胱注射递送AAV-retro时，未观察到脊髓运动神经元或盆腔神经节神经元的转导。这种差异可能是因为膀胱壁注射仅发生感觉轴突递送，导致很少AAV-retro进入血液。相反，全身和肌肉内递送时，更多AAV-retro可进入血液。支持这一观点的是，尾静脉注射AAV-retro时观察到脊髓腹角运动神经元的转导。
对转导的L6–S1 DRG神经元细胞类型分析显示，膀胱注射AAV-retro几乎均匀地转导了小、中、大直径神经元，但小直径神经元占比更高。进一步分析表明，AAV-retro转导了伤害性（TRPV1阳性）和非伤害性（NF-200阳性）神经元，以及肽能（CGRP阳性）和非肽能（IB4阳性）小直径神经元。转导的TRPV1阳性神经元比例相对较高，而CGRP阳性神经元比例相对较小。这些发现与先前关于AAV-retro在DRG神经元中转导的报告一致。尚不清楚AAV-retro转导明显偏好TRPV1阳性而非CGRP阳性神经元的原因，尽管先前报告显示膀胱感觉传入中有40%-50%为CGRP阳性。通常认为，来自中等直径DRG神经元的有髓鞘Aδ纤维负责正常排尿的启动，而来自小直径TRPV1阳性DRG神经元的无髓鞘C纤维负责膀胱疼痛反应。肽能和非肽能小直径神经元均参与疼痛处理。然而，在病理条件下，如脊髓损伤或慢性疼痛，小直径TRPV1阳性DRG神经元兴奋性增加可能促成OAB的发生。
体外钙成像证明，CNO激活AAV-retro-Gi显著抑制了转导神经元对高钾、辣椒素和机械通道Piezo1激动剂Yoda1等各种刺激的反应，表明兴奋性降低。这些体外功能发现，结合转导的细胞类型，为体内行为测试的观察结果奠定了基础。研究表明，在辣椒素膀胱内灌注诱导的急性疼痛模型和CYP诱导的慢性疼痛模型中，AAV-retro-Gi激活显著抑制了OAB表现，缓解了自发痛和诱发性疼痛行为，这可归因于过度兴奋的TRPV1阳性C纤维或NF-200阳性Aδ纤维的抑制。
本研究中，AAV-retro-Gi激活抑制了急慢性膀胱疼痛模型小鼠的冻结行为，但未影响舔舐疼痛行为。这表明冻结事件可能由激活盆腔神经中的膀胱传入神经引发，而舔舐行为由刺激阴部神经中的尿道传入神经诱导。这些发现进一步证明了膀胱内注射AAV-retro-Gi对膀胱感觉传入神经的特异性。
在正常小鼠中，AAV-retro-Gi激活抑制了排尿频率，降低了下腹部对Von Frey刺激的机械敏感性，但未
