RIPK3激酶结构域构象调控细胞死亡信号通路的机制研究

《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》：The kinase domain of RIPK3 tunes its scaffolding functions

本研究针对RIPK3激酶失活突变引发不同表型的科学问题，通过系统比较RIPK3D143N、RIPK3K51A和RIPK3D161N三种激酶死亡变体的稳定性及相互作用网络，发现激酶结构域构象差异决定了RIPK3在细胞死亡信号中的支架功能。研究证实RIPK3D143N突变小鼠可存活且能完全阻断坏死性凋亡，为靶向RIPK3的疾病治疗提供了新型安全策略。

　　

在细胞死亡研究领域，受体相互作用蛋白激酶3（RIPK3）一直是科学家们关注的焦点。这种蛋白不仅参与调控程序性坏死（necroptosis）这种炎症性细胞死亡方式，还与凋亡（apoptosis）信号通路存在复杂交叉。然而令人困惑的是，不同的RIPK3激酶失活突变在小鼠模型中表现出截然不同的表型：有些突变小鼠发育正常，而另一些却出现胚胎致死现象。这种差异背后的分子机制成为领域内亟待解决的科学问题。

传统观点认为，RIPK3主要通过其激酶活性磷酸化MLKL蛋白来执行坏死性凋亡功能。但越来越多的证据表明，RIPK3还可能通过非催化功能参与细胞死亡调控。特别值得注意的是，某些RIPK3小分子抑制剂在阻断坏死性凋亡的同时会意外触发凋亡，这种"双刃剑"效应严重限制了其 therapeutic potential。为了解开这个谜团，研究人员迫切需要一种能够精确区分RIPK3激酶活性与其支架功能的研究工具。

针对这一挑战，发表在《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》上的最新研究给出了突破性答案。研究团队通过系统比较三种不同的激酶死亡RIPK3突变体（RIPK3^K51A、RIPK3^D143N和RIPK3^D161N），揭示了激酶结构域构象如何精细调控RIPK3的支架功能，并成功构建了一种新型的RIPK3^D143N基因敲入小鼠模型。

研究采用的主要技术方法包括：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建RIPK3^D143N点突变小鼠模型；通过蛋白质热稳定性实验分析突变体构象变化；采用免疫共沉淀技术研究蛋白质相互作用网络；建立肠道上皮细胞特异性Caspase-8敲除的小鼠炎症模型；开发自动化免疫组化方法检测磷酸化RIPK3的空间分布。

研究结果部分显示：

"激酶结构域调控RIPK3介导的凋亡"部分发现，三种激酶死亡突变体虽然都丧失了催化活性，但在细胞死亡诱导能力上存在显著差异。RIPK3^D161N表现出强烈的组成型凋亡诱导活性，而RIPK3^D143N在TNF诱导的凋亡中功能完好，但对GSK'843诱导的凋亡不敏感。

"催化死亡的RIPK3^D143N保持稳定性及RIPK1-Caspase-8结合能力"部分证实，与其他突变体不同，RIPK3^D143N具有与野生型相当的蛋白质稳定性和相互作用模式，能够正常结合RIPK1和Caspase-8。

"成年Ripk3^D143N/D143N小鼠可存活、可育且表现正常"部分显示，尽管在胚胎期存在部分致死现象，但存活的小鼠发育正常，其细胞完全抵抗坏死性凋亡刺激而保留凋亡应答能力。

"RIPK3^D143N保护小鼠免受caspase-8缺失导致的胚胎致死"部分证明，该突变能够完全挽救Caspase-8缺失小鼠的胚胎致死表型，证实其有效阻断体内坏死性凋亡通路。

"RIPK3^D143N保护小鼠免受MLKL依赖性肠道炎症"部分发现，在肠道上皮特异性Caspase-8敲除模型中，RIPK3^D143N突变能够有效防止Paneth细胞丢失和回肠炎发生，效果与MLKL敲除相当。

研究结论与讨论部分强调，RIPK3激酶结构域的构象状态而非单纯的催化活性丧失，是决定其支架功能和小鼠表型的关键因素。RIPK3^D143N突变小鼠模型的成功建立，为区分RIPK3激酶依赖性与非依赖性功能提供了理想工具。这项研究不仅解决了长期困扰领域的科学争议，还为开发更安全的RIPK3靶向治疗策略指明了新方向——即寻找能够保持RIPK3支架功能的同时特异性阻断其激酶活性的化合物。该发现对理解细胞死亡信号转导的精细调控机制具有重要意义，并为炎症性肠病等多种疾病的治疗提供了新思路。