《Frontiers in Immunology》：Deep immune-phenotyping of HLA-homozygous iPS-cardiomyocytes by spectral flow cytometry
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本综述通过光谱流式细胞术深度解析HLA纯合诱导多能干细胞来源心肌细胞（iPS-CM）的免疫表型特征，揭示其低HLA-ABC表达及干扰素γ（IFN-γ）诱导的免疫调节分子（如PD-L1/CD274、CD47）动态响应，为异体心脏细胞治疗提供关键质量评估策略与半通用型细胞库建设依据。
1 引言
心血管疾病是全球发病和死亡的主要原因，心肌梗死导致约10亿心肌细胞永久性丧失。人诱导多能干细胞（hiPSC）技术为细胞替代疗法带来希望，但异体移植面临免疫排斥挑战。人类白细胞抗原（HLA）匹配是降低免疫原性的关键策略，而HLA纯合hiPSC库能通过单倍型匹配显著扩大适用人群。本研究聚焦hiPSC来源心肌细胞（iPS-CM）的免疫分子特征，旨在为心脏再生医学提供表型基准。
2 材料与方法
研究使用4个独立hiPSC系（包括HLA纯合系R26、MDCi246和杂合对照PMU1），在化学限定条件下分化为iPS-CM。通过354种抗体筛查免疫相关分子，并设计54个标志物的光谱流式 panel进行单细胞水平深度分析。采用干扰素γ（IFN-γ）刺激模拟炎症环境，通过t-SNE聚类评估表型稳定性。
3 结果
3.1 iPS-CM分化和表征
所有hiPSC系均成功分化为高纯度（cTNT+细胞占比86.45%-93.82%）iPS-CM，细胞团呈现典型囊状结构且钙黄绿素染色显示高活性。
3.2 免疫景观筛查
筛选发现101个分子在iPS-CM与hiPSC间差异表达。iPS-CM下调多能性标志物（Tra-1-60、SSEA-5）、HLA-ABC、β2微球蛋白（β2m）及免疫调节分子B7-H3（CD276），而上调黏附分子CD164（MUC24）和补体抑制因子CD59。
3.3 深度免疫表型分析
HLA纯合iPS-CM的HLA-ABC表达显著低于杂合对照，但其他免疫分子（如CD276、CD155）表达稳定。t-SNE显示不同批次细胞高度混合，无株系特异性聚类。发现CD235a（GYPA）阳性的心肌细胞亚群（1.42%-8.44%），可能反映心室分化早期特征。
3.4 炎症刺激响应
IFN-γ刺激诱导HLA-ABC、HLA-E、HLA-F、PD-L1（CD274）、PD-L2（CD273）和CD47显著上调，表明iPS-CM保留免疫应激响应能力。异常分化批次可通过CD276低表达被识别。
3.5 跨生产站点稳定性
三个独立站点生产的iPS-CM免疫表型高度一致，IFN-γ响应模式可重复。批次间变异主要体现在VCAM-1（CD106）和SIRPα（CD172a）表达波动，但无站点特异性趋势。
4 讨论
HLA纯合iPS-CM的低HLA-ABC表达可能降低T细胞介导的排斥风险，而完整的IFN-γ响应能力保障其微环境适应性。CD235a+亚群提示分化异质性，光谱流式 panel可敏感检测批次偏差。该研究为临床级iPS-CM的质量控制提供了高维表型参考框架，支持HLA半匹配细胞库的标准化建设。未来需结合功能实验验证其免疫原性及优化分化方案。
