《Frontiers in Aging Neuroscience》：Changes in the brain [NAD+]/[NADH] and [NADPH]/[NADP+] with aging and anti-aging dietary restriction
编辑推荐：
这篇前沿综述深入探讨了大脑细胞质与线粒体中NAD(H)和NAP(H)氧化还原态在衰老进程中的动态变化，及其如何受禁食与饮食限制(DR)调控。文章系统梳理了代谢物对比值（如丙酮酸/乳酸、乙酰乙酸/β-羟基丁酸）作为关键指标，揭示了不同物种（如C57BL/6J与C57BL/6N小鼠）及脑区在衰老过程中呈现相反的氧化还原变化。核心观点指出，禁食和DR诱导的周期性还原性转变（尤其是线粒体[NAD+]/[NADH]的降低）可能通过激活SIRT3/SIRT5、抑制SIRT4、增强代谢穿梭（如苹果酸-天冬氨酸穿梭MAS）等机制，促进神经保护并延缓脑衰老，为理解代谢干预延缓衰老提供了新视角。
1 引言
根据衰老的氧化还原理论，细胞内外及不同亚细胞区室中重要氧化还原对的变化是衰老的驱动因素之一。这些氧化还原对包括[NADPH]/[NADP+]、[NAD+]/[NADH]、谷胱甘肽(GSH)/氧化型谷胱甘肽(GSSG)以及半胱氨酸/胱氨酸。本综述重点关注神经细胞核质和线粒体中[NADPH]/[NADP+]和[NAD+]/[NADH]的变化。NAD(H)是约300个细胞反应的辅酶，其中绝大多数受[NAD+]/[NADH]调节。同样，NADP(H)是约100个细胞反应的辅酶，其中绝大多数受[NADPH]/[NADP+]调节。因此，这些氧化还原比值随衰老或饮食干预发生的变化对细胞代谢产生广泛影响。综述还涵盖了连接星形胶质细胞质[NADPH]/[NADP+]和[NAD+]/[NADH]的机制，因为这两个氧化还原对经常耦合在一起，同时被还原或氧化。文章重点指出，禁食会引起大脑细胞质[NADPH]/[NADP+]和[NAD+]/[NADH]以及大脑线粒体[NAD+]/[NADH]发生还原性转变，这与禁食期间肝脏中观察到的情况相似。
核质[NAD+]在禁食和饮食限制(DR)下在许多组织中会增加以激活去乙酰化酶Sirtuin，但核质[NADH]的增加幅度更大，至少在肝脏和许多脑区是如此，导致该氧化还原对的还原。出乎意料的是，C57BL/6J和C57BL/6N小鼠的大脑细胞质氧化还原状态随衰老呈现出相反的变化，这与大鼠大脑或小鼠肝脏中未观察到细胞质[NADPH]/[NADP+]或[NAD+]/[NADH]与衰老相关的变化形成对比。然而，一些证据表明，随着衰老，小鼠神经元或许还有其他神经细胞类型的线粒体[NAD+]/[NADH]会发生氧化。研究表明，禁食会导致小鼠大脑线粒体[NAD+]/[NADH]发生还原性转变，至少在特定脑区如此，这对抗了神经元中与衰老相关的氧化转变。间歇性禁食(IF)诱导大脑周期性代谢转换，这可能是由周期性氧化还原转换驱动的，并导致延缓线粒体[NAD+]/[NADH]随衰老发生的氧化，从而减缓大脑衰老的速度。
2 细胞质[NADPH]/[NADP+]和[NAD+]/[NADH]的氧化还原态在具有高苹果酸酶1(ME1)和LDH活性的细胞中相互关联
在至少具有中等细胞质苹果酸酶1(ME1)活性的细胞中，苹果酸/丙酮酸与细胞质[NADPH]/[NADP+]成正比。同样，在至少具有中等细胞质乳酸脱氢酶(LDH)活性的细胞中，丙酮酸/乳酸与细胞质[NAD+]/[NADH]成正比。由于丙酮酸同时出现在一个比值的分子和另一个比值的分母中，这使这两个比值反向关联，因此这两个氧化还原对最常同时被还原。这种关联在大鼠肝脏中被报道，其中48小时禁食导致两个氧化还原对发生化学还原，这在小鼠长期DR后也被发现，DR通过苹果酸/丙酮酸的变化推断增加了肝脏细胞质[NADPH]/[NADP+]，并通过丙酮酸/乳酸的变化证明降低了肝脏细胞质[NAD+]/[NADH]。衰老和DR期间血液及不同组织中氧化还原变化的总结如表1所示。
由于神经元和骨骼肌表达很少的ME1，它们可能比表达水平较高的肝脏或星形胶质细胞更容易受到衰老诱导的细胞质氧化还原失衡的影响。由于星形胶质细胞表达中等量的ME1以及乳酸脱氢酶亚基LDHA和LDHB，星形胶质细胞的[NADPH]/[NADP+]和[NAD+]/[NADH]部分反向关联，这可能有助于稳定细胞质氧化还原态以抵抗衰老相关的应激。增加的氧化还原应激与衰老导致的线粒体呼吸能力下降相关。与其维持的氧化还原能力一致，来自18个月大鼠的星形胶质细胞显示出比7个月大鼠更高的线粒体呼吸能力。不幸的是，在巨噬细胞或白色脂肪组织中，细胞质NADPH生成酶（如ME1、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)或异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)）的过表达超过2倍，会导致炎症和/或肥胖增加，这是由于NADPH氧化酶活性和脂质合成增加所致，因此限制了全球性增加ME1活性以稳定细胞质[NADPH]/[NADP+]和[NAD+]/[NADH]的抗衰老疗法的潜在效用。将表达ME1的病毒注射到大脑前庭核，诱导ME1水平增加2倍，在NDUFS4缺陷的Leigh综合征小鼠模型中改善了运动功能并减少了神经炎症，这与神经保护作用一致，尽管存活率未受影响。
3 禁食和DR期间，肝脏线粒体[NAD+]/[NADH]还原以抑制SIRT4，而线粒体[NAD+]增加以激活SIRT3和SIRT5
与NAD+不同，NADP(H)似乎不能跨线粒体内膜(IMM)运输。因此，绝大多数的线粒体基质NADP+来源于线粒体基质NAD+激酶2(NADK2)对NAD+的磷酸化。因此，为了更好地理解DR和禁食如何改变线粒体[NADPH]/[NADP+]，了解改变线粒体基质空间[NAD+]和[NAD+]/[NADH]的条件非常重要。大鼠肝脏中的乙酰乙酸/β-羟基丁酸被证明与肝脏线粒体[NAD+]/[NADH]成正比，并且进一步证明禁食2天使该比值从约8降至约5。同一小组表明，从分离的线粒体匀浆中测量总NAD+和NADH不能准确反映游离水平。另一组测量了小鼠肝脏乙酰乙酸/β-羟基丁酸，显示C57BL/6J小鼠肝脏线粒体[NAD+]/[NADH]被DR还原。
与禁食和DR诱导的啮齿动物线粒体（游离）[NAD+]/[NADH]的还原性转变相反，分离的小鼠肝脏总线粒体NAD+/NADH在禁食时显示出氧化性转变。因此，当需要具有生物学重要性的游离核苷酸比值时，总线粒体吡啶核苷酸水平的测量会产生误导。禁食或DR引起的肝脏线粒体NAD+水平增加被证明可以激活线粒体去酰基酶SIRT3和SIRT5。体外研究已证实，细胞SIRT1、SIRT2（大脑中表达最高的sirtuin）、SIRT3、SIRT5和SIRT6受[NAD+]调节，而不受[NAD+]/[NADH]调节，因为体外抑制sirtuin活性需要非生理性的毫摩尔水平的NADH。
与上述五种哺乳动物sirtuin相反，酵母SIR2和哺乳动物线粒体SIRT4被证明受[NAD+]/[NADH]调节，而不是受[NAD+]调节。当线粒体[NAD+]/[NADH]变得还原时，肝脏SIRT4被DR抑制，这与DR对线粒体SIRT3和SIRT5的激活相反。在使用胰腺胰岛或小脑时也发现了类似的结果。因此，禁食或DR导致的线粒体[NAD+]/[NADH]降低发生在多个组织中。还发现SIRT4在自由采食期间使线粒体丙二酰辅酶A脱羧酶(MLYCD)去乙酰化并抑制其活性，从而刺激线粒体脂肪酸合成，而DR阻止了这一过程。因此，禁食和DR使线粒体[NADH]的增加幅度超过线粒体[NAD+]，导致SIRT4抑制。动力学研究也证实SIRT4是第一个被发现受[NAD+]/[NADH]生理调节而非受[NAD+]调节的哺乳动物sirtuin，因为30 μM NADH（线粒体基质中存在的生理浓度）抑制了SIRT4活性。SIRT4晶体结构进一步证实NAD+结合位点也能容纳NADH。尚未明确证明[NAD+]还是[NAD+]/[NADH]主要调节主要定位于细胞核的SIRT7，但哺乳动物细胞中非常低的核质[NADH]表明SIRT7很可能受[NAD+]调节。
4 禁食导致大脑皮层和海马体细胞质[NAD+]/[NADH]和[NADPH]/[NADP+]发生还原性转变
研究表明，禁食3天使人类大脑枕叶乳酸水平增加近两倍，而一项对C57BL/6J小鼠的研究显示，禁食一夜使皮层乳酸水平增加60%，海马体乳酸水平增加30%，但丘脑、下丘脑或杏仁核的乳酸水平没有变化。该研究未测量禁食时的大脑丙酮酸水平。在另一项对C57BL/6J小鼠的研究中，小鼠禁食3、6、12或24小时，并对6个脑区和脊髓进行代谢组学分析。在大多数测量中，乳酸水平在禁食时没有变化，除了在脊髓和皮层中水平下降了约10%。禁食降低了海马体、脑干、嗅球和脊髓的丙酮酸水平，未改变大脑皮层和小脑的丙酮酸水平，并增加了下丘脑的丙酮酸水平。隔日喂养导致雌性小鼠大脑皮层丙酮酸/乳酸发生还原性转变，但雄性小鼠该脑区未发生此变化。数据表明，作为细胞质[NAD+]/[NADH]的衡量指标，丙酮酸/乳酸很可能在许多小鼠和人类脑区因禁食而变得更还原。
细胞质[NAD+]/[NADH]也可以通过组织α-酮丁酸/α-羟基丁酸来确定，因为这些代谢物也是乳酸脱氢酶的底物。将小鼠禁食长达24小时导致脊髓和所有6个测量脑区的α-羟基丁酸水平适度增加，进一步表明中枢神经系统细胞质[NAD+]/[NADH]因禁食发生还原性转变。禁食期间细胞质[NAD+]/[NADH]的这种还原性转变也可能发生在人类大脑长期禁食之后。大脑中这种禁食诱导的还原性氧化还原转变可能与禁食大鼠肝脏以及人类血浆和骨骼肌中发生的情况相似，这是通过丙酮酸/乳酸的变化测量得出的。研究表明，人类在禁食状态下运动时，血液乳酸水平的增加比进食状态下更多，导致丙酮酸/乳酸发生更大的还原性转变。
目前尚不清楚禁食或DR诱导的大脑和肝脏细胞质[NAD+]/[NADH]还原性转变的后果。细胞质[NAD+]/[NADH]的慢性还原性转变与胰岛素抵抗和线粒体疾病相关。Mark Mattson的研究小组强调了周期性代谢转换在间歇性禁食(IF)的神经益处中的重要性。因此，大脑和肝脏在正常氧化还原状态和禁食诱导的还原性氧化还原状态之间循环，可能提供了DR和IF的许多益处。禁食期间的核质还原性转变可能是有益的，因为[NAD+]水平增加激活sirtuins，而[NADH]水平增加幅度更大，从而激活苹果酸-天冬氨酸穿梭(MAS)，可能降低线粒体基质[NAD+]/[NADH]，这也可能在神经保护和延缓衰老中发挥作用。衰老在某些组织中会慢性降低细胞质[NAD+]/[NADH]，这是由于细胞质[NAD+]减少从而降低了sirtuin的激活。已证明在脂肪组织、肠道、肾脏和骨骼肌等组织中，NAD+水平随衰老而下降。因此，氧化还原辅酶的氧化形式和还原形式的绝对浓度、它们的比值、以及由此产生的氧化还原状态变化是慢性的还是周期性的，所有这些都可能是决定组织衰老速度的重要因素。
在禁食或DR期间，尚未测量作为细胞质[NADPH]/[NADP+]指标的大脑苹果酸/丙酮酸。但由于柠檬酸循环酶延胡索酸酶的高比活性，组织苹果酸和延胡索酸水平接近平衡，因此它们的水平最常成比例地改变。测量了不同脑区和脊髓中延胡索酸水平对禁食的反应。禁食使皮层、海马体、下丘脑、脑干、嗅球和脊髓的延胡索酸水平增加，但小脑没有增加。这些数据，加上同一项研究中上述测量的丙酮酸水平数据表明，禁食增加了延胡索酸/丙酮酸，因此也可能增加了苹果酸/丙酮酸，这指示了[NADPH]/[NADP+]在脊髓和几个脑区（包括海马体、脑干、嗅球，以及可能在较小程度上在皮层）增加，而在下丘脑可能降低。几个脑区细胞质[NADPH]/[NADP+]在禁食时的还原性转变，与上述某些脑区细胞质[NAD+]/[NADH]在禁食时的还原性转变一致，并且与丙酮酸/乳酸和苹果酸/丙酮酸之间的反向关联一致。
在人类长期禁食期间，骨骼肌丙酮酸释放到血液中的减少被假设导致血液和全身其他组织中苹果酸/丙酮酸和丙酮酸/乳酸的还原性转变。然而，禁食5-10天使大鼠比目鱼肌和心脏总NADPH/NADP+发生氧化性转变，而大鼠骨骼肌丙酮酸/乳酸要么没有变化，要么根据骨骼肌类型、动物年龄或禁食持续时间略有氧化。禁食1-2天使大鼠血液和心脏丙酮酸/乳酸发生氧化性转变。然而，小鼠禁食一夜或大鼠禁食3天使血液丙酮酸/乳酸发生还原性转变。因此，在短期禁食的小鼠和中长期禁食的大鼠和人类中，可能存在还原当量从骨骼肌向大脑和肝脏的转移。这可能通过骨骼肌释放丙酮酸相对于乳酸和苹果酸的相对减少而发生。与此一致的是，餐后，离开人体肌肉的静脉血丙酮酸/乳酸比进入肌肉的动脉血丙酮酸/乳酸还原12%，而在长期禁食期间，离开肌肉的静脉血丙酮酸/乳酸比进入的动脉血还原28%。
5 酮酯处理氧化了大脑皮层和海马体的细胞质[NAD+]/[NADH]，并还原了海马体的线粒体[NAD+]/[NADH]
禁食会系统性增加酮体水平。用酮酯[(R)-3-羟基丁基-(R)-3-羟基丁酸酯]处理3xTgAD阿尔茨海默病模型小鼠（该酯被代谢成两分子酮体β-羟基丁酸），使大脑皮层细胞质[NAD+]/[NADH]增加70%（从230到390），海马体[NAD+]/[NADH]增加65%（从250到410），这是根据丙酮酸/乳酸的增加推断的。这种变化主要是由丙酮酸水平增加驱动的。其他研究发现，生酮饮食增加了雄性Sprague Dawley大鼠海马体的总NAD+/NADH，但额叶皮层没有增加。引人注目的是，酮酯处理诱导的[NAD+]/[NADH]的这种氧化转变，以及生酮饮食期间总NAD+/NADH的氧化转变，与上述禁食期间在海马体和皮层发生的还原性转变相反。禁食和DR期间发生的系统性胰岛素水平降低和胰高血糖素水平升高可能起一定作用，因为它们在生酮饮食或酮酯消耗期间可能不会发生同等程度的变化。与禁食24-48小时的小鼠通常显示血浆β-羟基丁酸水平增加5到20倍不同，采用DR饮食的小鼠仅显示血浆β-羟基丁酸水平增加40%到2倍。因此，DR诱导的细胞质还原性氧化还原转变的发生独立于系统性酮体水平的巨大变化。
用酮酯处理3xTgAD阿尔茨海默病小鼠，降低了海马体线粒体[NAD+]/[NADH]，这由乙酰乙酸/β-羟基丁酸从9.3降至3.4（降低2.7倍）表明，而大脑皮层该比值没有显著变化。人类长期禁食也被证明会诱导血液乙酰乙酸/β-羟基丁酸发生还原性转变，这指示了线粒体[NAD+]/[NADH]，代表了一种总和性的系统性氧化还原变化。在人类长期禁食期间，离开肌肉和大脑的静脉血中乙酰乙酸/β-羟基丁酸比进入这些组织的动脉血中的比值略还原，肌肉中的还原转变幅度大约是大脑的3倍，而在禁食状态下，离开内脏床和肾脏的血液中乙酰乙酸/β-羟基丁酸比进入的血液略氧化。
6 衰老导致神经元线粒体[NADH]减少，体外补充半胱氨酸可恢复其水平
荧光寿命测量(FLIM)研究显示，与年轻成年小鼠相比，老年小鼠的培养神经元中线粒体NADH丰度下降，这可能表明老年神经元中线粒体[NAD+]/[NADH]被氧化。这表明，DR或酮酯处理延缓大脑衰老的一个重要作用机制可能是降低线粒体[NAD+]/[NADH]。一项研究还发现，向来自老年小鼠的分离培养神经元中添加半胱氨酸，增加了细胞半胱氨酸/胱氨酸，并将线粒体NADH水平恢复至年轻神经元的水平。通过降低线粒体[NAD+]/[NADH]，代谢功能可能得到增强，但半胱氨酸给药后实现这一点的机制仍有待探索。
半胱氨酸补充可能通过增加神经半胱氨酸分解代谢酶巯基丙酮酸硫转移酶(MPST)的通量来增加H2S的生成，尽管MPST在小鼠神经元中表达较低。当H2S浓度足够高时，会抑制线粒体电子传递链(ETC)复合物IV，从而减缓ETC复合物I对NADH的氧化，进而增加线粒体NADH水平以降低[NAD+]/[NADH]，可能延缓大脑衰老。H2S也可以将电子传递给泛醌，这可能会增加线粒体膜电位(ΔΨ)，产生热力学反压以减缓ETC通量，从而保存线粒体NADH。H2S水平增加也可能导致酶（如甘油-3-磷酸脱氢酶1(GPD1)或甘油-3-磷酸脱氢酶2(GPD2)）的过硫化物化（硫化），这些酶构成甘油-3-磷酸穿梭(G3PS)，从而增加细胞质NADH氧化还原穿梭。这可能导致细胞质[NAD+]/[NADH]通过将电子从细胞质NADH增加递送到线粒体泛醌而被氧化。
已知补充半胱氨酸可以增加神经元GSH的合成速率，从而提高细胞质和线粒体的GSH/GSSG，刺激谷氧还蛋白催化的蛋白质半胱氨酸去谷胱甘肽化。虽然ETC复合物I的去谷胱甘肽化已被证明可以增加其NADH氧化活性，但线粒体丙酮酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶的去谷胱甘肽化已被证明可以增加它们的活性，从而增加线粒体NADH的生成，这可能潜在地减缓衰老诱导的线粒体[NAD+]/[NADH]的氧化。因此，在禁食和DR期间，氧化还原调节的蛋白质去谷胱甘肽化可能与蛋白质过硫化物化共同作用，增加MAS、柠檬酸循环和脂肪酸β-氧化等途径的活性，从而降低线粒体[NAD+]/[NADH]以恢复衰老神经元的线粒体氧化还原状态。
7 大脑细胞质[NAD+]/[NADH]和[NADPH]/[NADP+]随衰老的变化具有啮齿动物品系和物种特异性
通过测量年轻和年老C57BL/6J小鼠大脑的代谢组，发现乳酸/丙酮酸（细胞质[NADH]/[NAD+]的代表）随衰老增加34%–52%，表明发生了细胞质还原性转变，这与在衰老神经元中发现的线粒体[NADH]的氧化相反。C57BL/6J小鼠大脑乳酸/丙酮酸随衰老的还原性转变几乎完全由丙酮酸水平下降30%–50%所驱动，而乳酸和苹果酸水平随衰老下降不到10%。C57BL/6J小鼠大脑苹果酸/丙酮酸随衰老的还原性转变表明，细胞质[NADPH]/[NADP+]也随衰老发生了还原性转变。细胞质[NAD+]/[NADH]和[NADPH]/[NADP+]随衰老的这些还原性转变与C57BL/6J小鼠总脑NAD+/NADH和NADPH/NADP+随衰老发生的还原性转变非常吻合。
在对C57BL/6N小鼠10个脑区在生命周期内4个时间点进行代谢组学分析时，另一个研究大脑衰老相关代谢物水平变化的课题组发现了关于丙酮酸水平如何随衰老变化的非常不同的结果。在59周（约15个月）和92周（约23个月）之间，所有脑区的丙酮酸水平增加了3到4倍，而乳酸水平随衰老缓慢增加，在不同脑区达到比年轻水平高10%（不显著）到显著高2倍的值。最终结果是在15个月龄后，所有脑区的乳酸/丙酮酸大幅下降，反映了大脑细胞质[NAD+]/[NADH]随衰老发生氧化性转变，这与在C57BL/6J小鼠大脑中发现的随衰老发生的还原性转变相反。
在人类大脑中，通过磁共振成像(MRI)测量NAD+和NADH得到的总NAD+/NADH被证明随衰老变得更还原。但更重要的人类大脑细胞质（游离）[NAD+]/[NADH]，通过MRI测量丙酮酸/乳酸，被证明随衰老变得更氧化。因此，C57BL/6N小鼠似乎是比C57BL/6J小鼠更好的人类大脑衰老氧化还原变化模型。研究表明，禁食36小时增加了大多数人类脑区的脑血流量(CBF)，尽管有少数脑区在饱食状态下显示CBF增加。注射乳酸以降低人类大脑丙酮酸/乳酸和细胞质[NAD+]/[NADH]也增加了CBF，表明细胞质[NAD+]/[NADH]的降低是禁食介导的CBF增加的驱动力。
在C57BL/6N小鼠大脑中，6个脑区的苹果酸水平随衰老没有变化，但其他4个脑区显著增加了10%到25%。因此，由于大脑丙酮酸水平随衰老增加更多，苹果酸/丙酮酸在15个月龄后大幅下降，反映了细胞质[NADPH]/[NADP+]随年龄发生氧化性转变，这又与使用C57BL/6J小鼠获得的结果相反。
令人惊讶的是，一个课题组发现GSH水平随衰老在C57BL/6N小鼠的脑干和小脑中增加，但在其他3个脑区没有增加。然而，另一个同样研究C57BL/6N小鼠的课题组发现，在15个月到23个月龄之间测量的所有10个脑区中，GSH/GSSG随衰老呈现还原性转变。这些结果也与C57BL/6J小鼠的结果相反。这些数据共同表明，在C57BL/6N小鼠中，谷胱甘肽二硫化物还原酶(GSR)活性随衰老保持低位，使得[NADPH]/[NADP+]和GSH/GSSG相对脱钩。这使得苹果酸/丙酮酸和[NADPH]/[
