《Frontiers in Nutrition》：Research on the mechanism of cow milk protein dietary intervention in ameliorating systemic chronic inflammation in type 2 diabetes by disrupting the ROS-M1 macrophage axis
编辑推荐：
本综述系统阐述了牛乳蛋白（CMP）通过其低水解度特性发挥抗α-淀粉酶活性和抗氧化作用，并在2型糖尿病（T2DM）模型中有效降低空腹血糖（FBG）、逆转体重减轻。CMP干预显著降低氧化应激标志物MDA和ROS，提升抗氧化酶GSH-Px活性，抑制巨噬细胞向M1表型极化并降低促炎细胞因子水平，同时改善肝脏脂质浸润、肠道病变、胰岛萎缩及肾脏肾小球肥大、糖基化和纤维化等病理改变，最终通过打破ROS–M1巨噬细胞恶性循环缓解T2DM系统性慢性炎症。
引言
根据国际糖尿病联盟2025年发布的数据，全球约有5.89亿成人糖尿病患者。中国糖尿病患者数量已达2.33亿，2005年至2023年间增长幅度达163.36%。糖尿病非典型临床症状和不明发病机制导致知晓率（36.7%）、治疗率（32.9%）和控制率（50.1%）均较低，给患者和社会带来沉重负担。美国糖尿病协会和营养与饮食学会建议通过生活方式改变，特别是自我营养支持疗法，改善糖尿病前期和T2DM患者的疗效和生活质量。将膳食蛋白质摄入量增加至总能量摄入的15–20%可有效控制血糖且不影响肾功能，其效果甚至可与某些口服药物相媲美。蛋白质还能诱导强烈饱腹感，增强胰岛素敏感性和分泌，因此成为预防和辅助治疗T2DM功能食品的关键成分。
大量研究表明氧化应激和巨噬细胞极化在T2DM慢性炎症和胰岛素抵抗中起关键作用。持续高血糖通过多种途径导致ROS过量产生。ROS不仅作为炎症信号直接激活免疫细胞，还刺激巨噬细胞极化为M1表型，分泌大量TNF-α、IL-6和IL-1β等炎症细胞因子，诱导脂肪组织和肝脏等靶器官慢性炎症，导致胰岛素抵抗。这些病理过程相互关联，形成恶性循环。胰岛素抵抗和β细胞损伤加重血糖血脂失调，进一步促进氧化应激，这种自我维持循环放大糖尿病及其并发症进展。CMP作为优质易吸收蛋白质，具有控制FBG、调节胰岛素分泌和敏感性、通过抗氧化特性调节炎症反应等多重益处，但其是否能调节巨噬细胞极化尚不清楚。因此，本研究旨在T2DM小鼠模型中研究CMP对系统性慢性炎症的保护作用，重点关注其抗氧化特性和巨噬细胞极化调节能力。
材料与方法
材料与试剂
CMP由山东盛源公司提供，酪蛋白（CS）购自甘肃华羚公司，乳清蛋白（WPC）购自爱尔兰Glanbia公司。IL-6、IL-10、IL-2和TNF-α ELISA检测试剂盒购自深圳新博生生物技术有限公司。MDA、SOD和GSH-Px检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。ROS检测试剂盒购自上海北博生物技术有限公司。胃蛋白酶（1:10000）、胰蛋白酶（1:250）、链脲佐菌素（STZ）、PAS染色试剂盒、H&E染色试剂盒、Masson三色染色试剂盒和免疫组化一抗（CD86、CD163）购自北京索莱宝科技有限公司。西格列汀磷酸片购自浙江默沙东制药有限公司。
体外半动态模拟消化
采用半动态模拟消化模型制备模拟胃液和肠液。为比较CMP的体外消化特性，按不同比例配制2%乳蛋白溶液（详见表1）。OPA法测定时，将30μL样品与240μL OPA试剂混合，使用Thermo Multiskan? FC酶标仪在340nm波长下测定吸光度（OD340）。以丝氨酸制作标准曲线，按公式1计算水解度：水解度（%）=（丝氨酸NH2?β）/（α?htot）?100。
体外消化产物抗α-淀粉酶和抗氧化活性评价
抗α-淀粉酶活性通过酶标仪在540nm波长下测定吸光度（OD540）评估。设立两个对照组：无淀粉溶液的实验对照组和无测试样品的样品对照组。按公式2计算α-淀粉酶抑制率：α-淀粉酶抑制率（%）= [1?（ODsample?ODsampleControl?ODblank）/（ODControl?ODblank）]?100。
羟自由基（·OH）清除能力通过酶标仪在536nm波长下测定反应混合物吸光度（OD536）评估。以无抗氧化剂的反应混合物为对照组，0.1mg/mL维生素C（Vc）为阳性对照，按公式3计算·OH清除率：OH清除率= [1?（ODsample?ODblank）/（ODControl?ODblank）]?100。
总还原力通过铁氰化钾还原法在700nm波长下测定吸光度（OD700）评估，还原能力以吸光度值表示，0.1mg/mL Vc为阳性对照。
动物实验
本研究经西北民族大学机构伦理委员会批准（伦理批准号：xbmu-sm-2024107）。48只6–8周龄雄性C57BL/6J小鼠（体重22–25g）购自中国农业科学院兰州兽医研究所。动物饲养环境恒定温度20±5°C、湿度50%±5%，12小时光暗循环，自由摄取标准维持饲料和纯净水。适应1周后，随机分为两组：普通饮食组（脂肪含量4.3% w/w，热量10%）（NC组，N=12）和高脂饮食组（脂肪含量35% w/w，热量60%）（HFD组，N=36）。第四周末，HFD组小鼠连续3天腹腔注射溶解于0.05M无菌柠檬酸钠缓冲液（pH 4.5）的STZ（50mg/kg）。尾静脉穿刺使用手持血糖仪测量FBG和随机血糖。FBG≤11.1mmol/L的小鼠额外注射STZ（30mg/kg）2天。末次注射后3天和1周重新评估FBG。两次FBG>11.1mmol/L的小鼠视为成功建立T2DM模型。正常对照组同时注射等体积柠檬酸钠缓冲液。成功建模后，T2DM小鼠随机分为三组（每组N=12）：T2DM模型（DM）组、SIG组和CMP组。8周干预期间，所有小鼠每日灌胃。NC和DM组给予纯净水（10mg/kg/天），SIG和CMP组分别给予SIG（10mg/kg/天）和CMP（200mg/kg/天）。每2周记录体重和FBG水平。实验流程详见图1。
干预8周后，动物禁食12小时，腹腔注射10%（w/v）戊巴比妥钠麻醉。下腔静脉采集全血至2mL离心管。血样25°C静置2小时后，4°C离心247×g 15分钟。上清转移至1.5mL离心管，-80°C保存。颈椎脱臼处死小鼠，收集肾脏、肝脏、回肠和胰腺。组织分为两部分：一份-80°C保存备用，另一份固定于固定液用于组织学分析。收集内脏脂肪组织用于流式细胞术分析。
生化指标检测
尾静脉穿刺使用血糖仪（GLM-77，青岛雅斯生物科技）测量FBG。ELISA试剂盒检测血清IL-6、IL-10、IL-2和TNF-α水平。全自动生化分析仪（SAL9000，深圳迈瑞）测量血清肝功能标志物（AST、ALT）和肾功能指标（CREA、UREA、UA）。按相应试剂盒说明书分别测量肝匀浆氧化应激相关标志物MDA、SOD、GSH-Px和ROS。
流式细胞术分析
混合酶溶液消化小鼠内脏脂肪组织，流式细胞术鉴定M1和M2巨噬细胞。M1巨噬细胞标记为CD86+，M2巨噬细胞标记为CD163+，使用流式细胞仪（BriCyte E6，深圳迈瑞）定量。
组织病理学检查
肾切片进行H&E、Masson三色和PAS染色，光学显微镜下观察肾组织病理变化。肝、胰腺和回肠切片经H&E染色后检查。胰腺石蜡切片进行免疫组化染色，分别与CD86和CD163一抗孵育，显示M1和M2巨噬细胞表达。
统计分析
所有数据均使用SPSS软件（IBM SPSS Statistics 27）进行三次重复分析。单因素方差分析（ANOVA）后，采用Waller–Duncan事后检验评估组间差异。同一面板中标注不同小写字母的柱状图表示统计学显著差异（p<0.05）。数据以均值±标准差表示。使用ImageJ软件进行组织切片分析。GraphPad Prism软件（GraphPad Prism 9.5）用于数据可视化和统计绘图。计算Pearson相关系数评估变量间两两关联。相关系数绝对值（|r|）表示相关强度，|r|越大关联越强。图中边宽与|r|成比例，仅用于提高可视化可读性。
结果
消化产物抗α-淀粉酶和抗氧化活性评价
半动态消化模型模拟乳蛋白消化结果见图2。模拟胃阶段，100% CMP水解度在30、60、90和120分钟时显著高于100% CS组（图2A，P<0.05）。肠阶段，100% CS和100% CMP组水解度在所有时间点均显著低于20% CS+80% WPC和100% WPC组，而100% CS与100% CMP组间无显著差异（图2A，P<0.05）。100% CS和100% CMP水解物体外α-淀粉酶抑制率显著高于其他组（图2B，P<0.05）。100% CMP水解物·OH自由基清除率低于50% CS+50% WPC水解物，与其他三组无显著差异（图2C）。100% CMP水解物铁氰化钾还原力显著强于100% CS水解物，但弱于100% WPC水解物（p<0.05），其余两组间无显著差异（图2D）。因此，选择CMP进行后续体内实验，因其具有优良消化性、抗α-淀粉酶活性和抗氧化特性。
CMP对空腹血糖和体重的影响
为探究CMP对T2DM小鼠基本生理指标的影响，监测8周干预期间体重和FBG水平，结果见图3。NC组FBG在整个干预期间保持正常范围。干预开始时（第0周），DM、SIG和CMP组FBG均超过11.1mmol/L。DM组在整个8周期间保持高血糖状态。第2至8周，SIG和CMP组FBG均显著低于DM组（p<0.05），两组间无差异（图3A）。体重监测显示NC组干预期间持续增重，而DM组持续体重减轻。CMP和SIG干预在4周内逐渐逆转这种体重减轻，与NC组无差异。第6周时SIG组增重率最高。第8周时所有组体重变化减缓，体重趋于稳定（图3B）。
CMP对T2DM小鼠氧化应激和巨噬细胞极化的影响
为探究CMP是否改善T2DM氧化应激和巨噬细胞极化，检测CMP干预后氧化应激相关指标和内脏脂肪组织及胰腺组织中巨噬细胞亚型，结果见图4。与NC组相比，DM组氧化应激标志物MDA和ROS水平显著升高（图4A、B，P<0.05），抗氧化酶GSH-Px活性显著降低（图4C，P<0.05），SOD活性仅轻微降低（图4D，P>0.05）。与DM组相比，CMP和阳性对照SIG组均使氧化应激相关指标恢复至与NC组相当水平（图4A–D）。同时，与NC组相比，DM组内脏脂肪和胰腺组织中M1和M2巨噬细胞表达均增加（图4E–L，P<0.05），但M1巨噬细胞增加幅度大于M2，导致此时M1/M2比值升高。与DM组相比，CMP和SIG呈现相似调节趋势：两者均降低M1巨噬细胞表达（图4F、K，P<0.05），增加M2巨噬细胞表达（图4G，P>0.05；L，p<0.05），关键的是两种干预均有效降低M1/M2比值（图4H、M，P<0.05）。
CMP对T2DM小鼠系统性慢性炎症损伤的影响
进一步研究CMP是否缓解T2DM小鼠系统性慢性炎症损伤，评估血清炎症因子、肝肾功能以及肝、回肠和胰腺组织学，结果见图5、6。与NC组相比，DM组血清促炎细胞因子IL-2、IL-6和TNF-α水平显著升高（p<0.05）。CMP和SIG使IL-2和TNF-α水平显著下降，效果与NC组相当无差异，IL-6仅呈下降趋势（图5A）。血清生化分析显示DM组ALT和AST活性较NC组显著升高，但CMP和SIG治疗显著降低这些酶水平（p<0.05），且SIG组效果优于CMP组（图6A、B）。DM组出现严重肝脏病理改变：细胞排列紊乱、炎症浸润、细胞肿胀、明显脂肪变性和血窦狭窄。CMP和SIG干预后这些组织病理变化明显改善，尤其明显脂肪变性显著减轻，定量分析证实（图5B、6C，P<0.05）。DM组回肠绒毛显著缩短，绒毛顶端脂肪空泡面积显著增加。CMP和SIG治疗后这些回肠损伤显著改善（图5D、E、6D、E，P<0.05）。NC组胰岛形态正常，边界清晰、形状规则、细胞排列整齐、核深染、胞质丰富；DM组胰岛损伤显著，边界模糊、萎缩、细胞紊乱、核增大、轻度异型性。CMP和SIG治疗有效恢复胰岛形态，面积较DM组增加（图5F、6F，P>0.05）。DM组血清UREA、CREA和UA水平较NC组显著升高，但CMP和SIG干预显著降低这些标志物（图6G–I，P<0.05），尽管CMP组CREA降低无统计学意义。DM组小鼠出现严重肾脏病理改变：组织排列松散、结构紊乱、明显系膜扩张和肾小球显著增大。CMP和SIG干预后这些病理改变明显改善（图5G、6J，P<0.05）。DM组肾小球基底膜显著增厚、系膜基质扩张和PAS阳性物质沿肾小球毛细血管壁沉积明显增加。CMP和SIG干预后这些病理特征显著改善（图5H、6K，P<0.05）。此外，与NC组相比，DM组肾小球和肾小管间质蓝色胶原纤维沉积显著增加，而CMP和SIG治疗显著改善这种纤维化改变（图5I、6L，P<0.05）。
相关性分析
Pearson相关性分析考察FBG、氧化应激标志物水平、巨噬细胞极化标志物、炎症细胞因子表达和系统性慢性炎症指标间关系（图7）。FBG水平与氧化应激因子（MDA、ROS）、M1巨噬细胞水平和M1/M2比值呈正相关，与抗氧化酶（GSH-Px、SOD）活性呈负相关。氧化应激因子与促炎细胞因子（IL-2、IL-6、TNF-α）呈正相关，而抗氧化参数与抗炎细胞因子IL-10呈正相关。促炎细胞因子与肝肾功能损伤指标（ALT、AST、CREA、UREA、UA）呈正相关，也与组织病理损伤标志物（肝脂肪浸润、肾小球面积、肾脏糖基化和纤维化）呈正相关。相反，抗炎因子IL-10与胰岛面积和肠绒毛长度呈正相关。
讨论
乳蛋白主要成分为CS和WPC。CS约占乳蛋白80%，在胃消化中占主导，胃内形成凝块增加胃内容物粘度，延迟胃排空，产生 prolonged physical satiety，导致血浆氨基酸浓度适度延迟升高，因此CS被视为“慢”蛋白。相反，WPC作为“快”蛋白，可快速升高血浆氨基酸水平诱导饱腹感并强烈促进胰岛素分泌，从而快速降低餐后血糖。尽管CS和WPC对饱腹感和食物摄入的影响不完全一致，但两种蛋白均有效刺激胃肠道释放饱腹激素。通过增加血浆氨基酸水平，触发GLP-1和PYY分泌，向大脑发出强烈信号抑制食欲。本研究中，体外半动态模拟消化实验表明，CMP在4小时消化期内呈现与CS相似的消化动力学，比WPC更具消化抗性。这种特性支持餐间稳定持续供应氨基酸，延长饱腹感。此外，CMP和CS消化物上清液比含更高比例WPC的乳蛋白配方具有更强抗α-淀粉酶活性，而较高WPC含量消化物比CS消化物显示更优抗氧化活性。因此，综合考虑这些因素和生产投入产出比，选择CMP作为研究对象，进一步探索其在T2DM防治中的潜在机制。
T2DM核心特征包括糖代谢紊乱导致的持续高血糖，临床表现为多饮、多食、多尿和不明原因体重减轻等典型症状。本研究证明CMP有效降低T2DM模型小鼠FBG水平，缓解糖尿病所致体重减轻，疗效与SIG治疗相当。我们假设CMP干预在抑制食欲的同时，为机体提供大量优质蛋白，还可能通过减少氧化应激和调节巨噬细胞极化改善胰岛素抵抗和减轻β细胞损伤。
ROS与机体抗氧化防御系统失衡引起的氧化应激是T2DM及其相关并发症发病机制的关键因素。持续高血糖导致线粒体内葡萄糖代谢过度，产生大量超氧阴离子等ROS，多元醇和己糖胺途径以及AGEs形成进一步加剧此过程。谷胱甘肽水平降低反映氧化应激恶化。CMP干预不仅有效降低T2DM小鼠ROS和MDA水平，还显著提高抗氧化酶GSH-Px活性，表明CMP可靶向氧化应激调节，可能为管理T2DM及其并发症提供新治疗选择。同时，ROS可诱导巨噬细胞积累和活化，导致脂肪组织、胰腺和肝脏中巨噬细胞浸润增加，促进M2向M1表型转变和炎症细胞因子（TNF-α和IL-6）分泌，最终驱动胰岛素抵抗。因此，调节巨噬细胞极化是T2DM的潜在治疗策略。本研究结果表明CMP和SIG均有效减少巨噬细胞向M1表极极化并促进其向M2表极极化，在内脏脂肪和胰腺组织中均如此。更重要的是，多数学者认为降低巨噬细胞M1/M2比值是控制系统炎症的更有效策略。CMP干预后，T2DM小鼠内脏脂肪和胰腺组织中M1/M2比值显著降低，与SIG效果一致，表明CMP可能作为系统性免疫调节剂改善T2DM。
氧化应激和巨噬细胞极化并非T2DM发展中的孤立事件，而是形成相互促进的恶性循环。氧化应激驱动M1巨噬细胞极化，反之M1极化增强氧化应激。这种恶性循环促进大量炎症因子释放，诱导胰岛素抵抗并导致β细胞损伤。 consequently，血糖更难控制，进一步加剧高血糖，产生更多ROS。最终，这种恶性循环不断放大，驱动糖尿病及其并发症进展。本研究进一步探讨CMP是否能改善T2DM小鼠系统性慢性炎症。结果显示CMP显著抑制促炎因子（IL-2、IL-6、TNF-α）过表达，促进抗炎因子IL-10表达，这与既往
