聚乙烯亚胺修饰脂质体/丝素蛋白绿色电纺支架实现BMP2基因缓释与成骨分化增效

《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：A green-electrospun nanofibrous scaffold incorporating polyethylenimine-modified liposomes for sustained BMP2 gene delivery and enhanced osteogenic differentiation

本研究开发了一种基于绿色电纺技术的多功能纳米纤维支架，将聚乙烯亚胺（PEI）修饰的脂质体（LipoPEI）负载BMP2基因（pDNABmp2）整合至丝素蛋白（SF）-聚环氧乙烷（PEO）纳米纤维中。该支架不仅模拟天然细胞外基质（ECM）结构，更通过非病毒基因递送系统实现骨形态发生蛋白2（BMP2）的持续表达，显著增强骨髓间充质干细胞（BMSCs）的成骨分化，为骨组织工程提供了环境友好且高效的新型平台。

　　

引言

骨组织再生是骨科、牙科和重建外科领域的重大临床挑战。大段骨缺损常超出机体自愈能力，而自体移植存在来源有限和供区并发症等问题。骨组织工程通过构建功能性人工骨替代材料为解决这一难题提供了新思路。其中，三维支架作为细胞生长的模板至关重要，而电纺纳米纤维支架因其能模拟天然细胞外基质的拓扑结构而备受关注。丝素蛋白（SF）作为一种天然蛋白质聚合物，具有优异的生物相容性、可降解性和力学性能，其水溶液处理特性更符合绿色制造理念。为增强支架成骨诱导能力，研究聚焦于骨形态发生蛋白2（BMP2）——一种强效成骨诱导因子。然而直接使用重组BMP2蛋白存在半衰期短、需超生理剂量等问题。基因治疗通过递送BMP2编码质粒（pDNA_Bmp2），使细胞持续表达治疗性蛋白，为非病毒基因载体如阳离子脂质体与聚乙烯亚胺（PEI）结合的杂化系统（Lipo^PEI）提供了应用空间，这类系统能平衡转染效率与生物安全性。

材料与方法

研究采用绿色电纺技术，以水相SF和聚环氧乙烷（PEO）溶液制备纳米纤维支架，避免使用有毒有机溶剂。通过薄膜水化法制备PEI修饰的脂质体（Lipo^PEI），并负载BMP2编码质粒形成pDNA_Bmp2@Lipo^PEI纳米复合物。将纳米复合物按不同比例（Lipo^PEI相对于SF质量比为0.2%、0.4%、0.6%）加入SF-PEO纺丝液，优化电纺参数后制备四组支架：SF-PEO、Lipo^PEI@SF-PEO（空载体）、pDNA_Bmp2@SF-PEO（裸质粒）及pDNA_Bmp2@Lipo^PEI@SF-PEO。支架经75%乙醇蒸汽处理后诱导SF构象转为水不溶性β-折叠结构。通过扫描电镜（SEM）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、X射线衍射（XRD）等表征支架形貌与结构，并评估质粒DNA的体外释放动力学。以大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）为模型，通过MTT法、SEM观察细胞活性与形态，共聚焦显微镜检测基因转染效率（GFP报告基因），并测定碱性磷酸酶（ALP）活性和阿尔新红（ARS）染色评估成骨分化。

结果

纳米载体表征显示，pDNA_Bmp2@Lipo^PEI纳米颗粒粒径约为266纳米，zeta电位为+16.9毫伏，透射电镜（TEM）证实其呈球形且分散均匀，质粒包封率达66.23%。SEM显示所有支架均形成连续、光滑的带状纳米纤维结构，负载基因的支架纤维直径略有增加（460–541纳米），荧光显微镜证实脂质体均匀分布于纤维中。FTIR与XRD分析表明乙醇处理成功诱导SF从无规卷曲/α-螺旋向β-折叠构象转变，显著提升支架稳定性。体外释放实验表明，pDNA_Bmp2@Lipo^PEI@SF-PEO支架在14天内实现DNA的持续缓释，而裸DNA支架释放更快。细胞实验显示，所有支架均支持BMSCs的良好增殖与铺展，复合支架组细胞活性显著高于玻璃对照组。共聚焦成像可见pDNA_Bmp2@Lipo^PEI@SF-PEO组细胞表达绿色荧光蛋白，转染效率与阳性对照组相当。成骨分化评估中，基因激活支架组在培养21天后ALP活性显著升高，ARS染色显示大量钙结节形成，表明BMP2的持续表达有效促进了BMSCs的成骨分化。

讨论

本研究成功将绿色电纺工艺与非病毒基因递送系统结合，构建了兼具结构支持与基因激活功能的骨组织工程支架。水相加工不仅避免了有机溶剂对生物活性的影响，还体现了环境可持续性。Lipo^PEI载体在保护基因的同时，与SF纤维协同实现了质粒的缓释，为长期成骨诱导提供了基础。支架优异的生物相容性源于SF的天然特性与纳米纤维结构，而BMP2基因的成功转染与表达则通过激活Smad等信号通路驱动了成骨分化进程。这种多组分协同策略为骨再生提供了新思路，但后续需进一步开展动物体内实验、力学性能及降解动力学研究以推动临床转化。

结论

本研究通过全水相绿色电纺技术构建了负载BMP2基因的SF-PEO纳米纤维支架。该支架具有良好的生物相容性、可控的基因释放特性及显著的成骨诱导能力，为骨缺损修复提供了一种安全、高效且环境友好的新型材料平台。