丹参来源囊泡样纳米颗粒功能化水凝胶在脓毒症心肌损伤中的氧化应激调控与抗心肌细胞凋亡作用研究

《Plant Biotechnology Journal》：Salvia miltiorrhiza-Derived Vesicle-Like Nanoparticles Functionalised Hydrogel With Excellent Ability of Oxidative Stress Modulation and Anti-Cardiomyocyte Apoptosis for Sepsis-Induced Myocardial Injury

本文创新性地将丹参来源囊泡样纳米颗粒（SDVLNs）负载于温敏水凝胶构建SDVLNs@Hydrogel（SDVLNHs）递送系统，通过体外实验证实SDVLNs可促进心肌细胞增殖迁移、缓解氧化应激、调控线粒体功能并抑制细胞凋亡；体内实验证明局部给药的SDVLNHs能显著改善LPS诱导脓毒症心肌损伤小鼠的心功能及病理损伤，为心肌损伤修复提供了兼具ROS响应释放特性和线粒体靶向修复功能的新型治疗策略。

　　

1 引言

脓毒症作为由感染引起的危及生命的器官功能障碍，每年全球约3000万患者受累，死亡率高达50%-70%，其中心肌损伤是最常见且严重的并发症。氧化应激被认为是疾病发生发展的重要因素，线粒体损伤导致的活性氧（ROS）过度产生会引发心肌细胞死亡和组织损伤。细胞外囊泡（EVs）作为磷脂双分子层包裹的生物颗粒，在细胞间通讯中发挥重要作用。植物来源囊泡样纳米颗粒（PDVLNs）具有来源丰富、生物相容性好等优势，而丹参作为传统中药材，其活性成分在心血管保护方面具有显著功效。本研究通过将丹参来源纳米颗粒（SDVLNs）与温敏水凝胶结合，构建SDVLNs@Hydrogel（SDVLNHs）递送系统，旨在解决SDVLNs储存难题并提升其对脓毒症心肌损伤的治疗效果。

2 材料与方法

2.1 SDVLNs的分离纯化与表征

通过差速离心法从新鲜丹参中分离SDVLNs，透射电镜（TEM）显示其呈膜包被的囊泡状结构，纳米颗粒追踪分析（NTA）表明粒径分布为75.0-585.0 nm，中位直径255.0 nm，Zeta电位为-12.1 mV。BCA法测定蛋白浓度为3.10 mg/mL。

2.2 细胞实验

采用H9C2心肌细胞系，通过Calcein-AM/PI双染色、CCK-8检测细胞活力，LDH释放实验评估细胞毒性，EdU染色分析增殖能力，划痕实验检测迁移能力，DCFH-DA探针测定ROS水平，JC-1染色评估线粒体膜电位（MMP），Seahorse能量代谢分析仪检测线粒体呼吸功能（OCR）和糖酵解速率（ECAR），Western blot检测Bcl-2、Bax、Caspase-3、Cleaved-caspase-3和细胞色素c（Cyt c）等凋亡相关蛋白表达。

2.3 SDVLNHs的制备与表征

将SDVLNs与20% Pluronic F-127温敏水凝胶混合制备SDVLNHs。流变学测试显示其储能模量（G′）高于损耗模量（G″），扫描电镜（SEM）呈现多孔层状结构。在H₂O₂溶液中14天内SDVLNs累积释放率达98.98%，显著高于PBS组的12.92%。

2.4 动物实验

通过腹腔注射LPS（20 mg/kg）建立脓毒症心肌损伤小鼠模型，分组为假手术组、LPS组、水凝胶组、SDVLNs组和SDVLNHs组。治疗后第0、1、7、14天进行心脏超声（ECHO）检测射血分数（EF）、短轴缩短率（FS）、左心室舒张末期内径（LVIDd）和收缩末期内径（LVIDs），组织切片进行HE染色病理评分，并检测超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量。

3 结果

3.1 SDVLNs表征

TEM显示SDVLNs具有典型囊泡结构，粒径分布均匀，Zeta电位负值表明颗粒稳定性良好。

3.2 SDVLNs促进心肌细胞增殖迁移

CCK-8实验表明10 μg/mL SDVLNs可显著逆转H₂O₂诱导的心肌细胞活力下降。Calcein-AM/PI染色显示SDVLNs处理组活细胞比例显著升高，LDH释放减少。EdU染色和划痕实验分别证实SDVLNs能促进细胞增殖和迁移。

3.3 SDVLNs的抗氧化与抗凋亡作用

DCFH-DA染色显示SDVLNs处理显著降低H₂O₂诱导的ROS水平升高。JC-1染色表明SDVLNs能维持线粒体膜电位稳定。Seahorse分析显示SDVLNs改善线粒体基础呼吸、最大呼吸能力和ATP产量。Western blot结果显示SDVLNs上调Bcl-2表达，下调Bax、Cleaved-caspase-3和Cyt c表达。

3.4 SDVLNHs的特性

SDVLNHs在37°C发生溶胶-凝胶转变，呈现ROS响应释放特性。体内分布实验显示DiR标记的SDVLNHs在心区荧光强度是游离SDVLNs的20倍以上，表明其具有更优的心脏靶向性和滞留性。

3.5 SDVLNHs改善心功能

超声心动图显示SDVLNHs治疗组EF和FS值显著高于LPS组，LVIDs和LVIDd扩张得到抑制。HE染色显示SDVLNHs组心肌纤维排列整齐，炎性浸润和水肿减轻。

3.6 SDVLNHs抑制氧化应激与凋亡

与LPS组相比，SDVLNHs治疗组心肌组织SOD活性升高，MDA含量降低，ROS荧光强度减弱。Western blot显示SDVLNHs显著调节Bcl-2/Bax比值，抑制Caspase-3活化和Cyt c释放。

4 讨论

本研究成功构建了兼具ROS响应性和线粒体保护功能的SDVLNHs递送系统。SDVLNs通过多组分协同作用调控氧化应激和线粒体功能，而水凝胶载体不仅解决了SDVLNs的稳定性问题，还实现了心肌靶向递送和持续释放。该策略为脓毒症心肌损伤的治疗提供了新思路，但仍需进一步解析SDVLNs活性成分及其作用机制。

5 结论

SDVLNHs通过清除ROS、维持线粒体功能和抑制细胞凋亡，有效缓解脓毒症引起的心肌损伤。这种结合天然产物纳米技术和先进生物材料的设计理念，为心血管疾病治疗提供了具有临床转化潜力的新型平台。