《Journal of Biological Chemistry》：Conformation-specific monoclonal antibodies reveal early Tau structural intermediates in Alzheimer’s disease
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本研究针对tauopathy早期诊断和治疗瓶颈，通过开发构象特异性单克隆抗体（mAbs）系统解析阿尔茨海默病（AD）等Tau蛋白病的分子病理机制。研究发现靶向R1-R3区域的16B12抗体可特异性识别早期Tau构象中间体，有效抑制体外Tau聚集和种子诱导的纤维形成；9H6F2抗体则通过检测P1-P2相互作用成为跨Tau蛋白病的广谱生物标志物。该研究为早期诊断和靶向治疗提供了新型分子工具，发表于《Journal of Biological Chemistry》。
在神经退行性疾病研究领域，Tau蛋白病是一组与年龄相关的异质性疾病，包括阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease, AD）、进行性核上性麻痹（Progressive Supranuclear Palsy, PSP）、皮质基底节变性（Corticobasal Degeneration, CBD）等。这些疾病的共同特征是Tau蛋白的错误折叠和异常聚集，形成神经原纤维缠结（Neurofibrillary Tangles, NFTs）和神经毡线程（Neuropil Threads, NTs），最终导致神经元功能障碍和死亡。尽管冷冻电镜（cryo-EM）技术已经揭示了成熟Tau纤维的结构特征，但对早期Tau构象中间体的认识仍然有限，这限制了早期诊断和靶向治疗策略的发展。当前的治疗方法难以有效阻断疾病进展，部分原因在于缺乏高灵敏度、高特异性的分子探针来识别早期病理性的Tau构象。
为了突破这一瓶颈，研究人员在《Journal of Biological Chemistry》上发表了题为“Conformation-specific monoclonal antibodies reveal early Tau structural intermediates in Alzheimer’s disease”的研究。该研究通过开发和应用一系列单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAbs），系统性地分析了Tau蛋白在AD和其他Tau蛋白病中的构象变化，旨在揭示早期Tau病理结构的特征，并评估这些抗体在诊断和治疗中的应用潜力。
研究团队首先扩展了已有的mAb库，生成了两种新型抗体9H6F2和11E12E10，并通过ELISA（酶联免疫吸附测定）和肽阵列扫描技术确定了它们的表位。9H6F2识别P1和P2富含脯氨酸区段的不连续表位，而11E12E10靶向R1重复区内的线性表位。随后，研究人员利用夹心ELISA（sandwich ELISA）分析了九种mAb（包括新生成的和已有的）对不同来源Tau蛋白（如大肠杆菌表达的Tau、酵母表达的磷酸化Tau和肝素诱导的纤维化Tau）的结合特性，揭示了Tau蛋白在磷酸化和纤维化过程中的构象变化。
在诊断潜力评估方面，研究团队通过免疫组织化学（Immunohistochemistry, IHC）对来自不同Braak分期（Braak staging）的AD患者脑组织切片进行了分析。结果显示，多种mAb（如ADx215、9H6F2、15A10、ADx201、16B12和20G10）能够灵敏地检测早期AD病理（Braak I–III期）中的Tau病变，其性能与金标准抗体AT8（识别磷酸化TauSer202/Thr205）相当，甚至优于构象特异性抗体MC1。特别值得注意的是，构象特异性抗体16B12（靶向R1和R3区的不连续表位）在早期Braak分期（I–III期）中显示出更高的灵敏度，表明R1模糊区（fuzzy coat）在Tau纤维成熟早期即被整合到C端核心结构中。此外，16B12还能在原发性视网膜Tau蛋白病（Primary Retinal Tauopathy, PReT）的早期阶段（0期和1期）检测到Tau构象变化，而MC1在这些阶段则为阴性，进一步证实了16B12在识别早期Tau病理中的优势。
在治疗潜力方面，体外实验表明，16B12能够以剂量依赖的方式有效抑制重组Tau（recombinant Tau, rTau）的成核和聚集。在Tau生物传感器细胞（Tau biosensor cells）实验中，16B12与AD患者脑源性Tau种子（Tau seeds）预孵育后，显著降低了种子的延伸能力，而其他mAb（如9H6F2和11E12E10）则未表现出明显的抑制效果。这表明16B12通过靶向R1-R3相互作用，干扰了Tau种子依赖的纤维形成过程，具备开发为Tau靶向免疫疗法的潜力。
关键技术方法包括：利用酵母表达系统获得磷酸化人源Tau2N4R-ΔK280作为免疫原；通过杂交瘤技术生成单克隆抗体；采用ELISA、肽阵列扫描和免疫印迹进行表位鉴定和抗体特性分析；基于夹心ELISA和免疫组织化学评估抗体结合性能；使用硫黄素T（Thioflavin T, ThT）荧光动力学分析和Tau生物传感器细胞系进行体外聚集和种子抑制实验；人脑组织样本来源于大学医院生物样本库，涵盖AD、PSP、CBD、PiD等多种Tau蛋白病病例。
生成两种新型Tau抗体并确定其表位
研究人员以酵母表达的人源Tau2N4R-ΔK280为抗原，通过杂交瘤技术获得9H6F2和11E12E10两种新型mAb。肽阵列扫描显示，9H6F2识别P1（161GQKGQANA(TRIPAK)TPPAPKTP182）和P2（219PTREPKKV226）区的不连续表位，而11E12E10靶向R1区的线性表位251PDLKNVKS258。磷酸化修饰会影响二者的结合亲和力。
基于表位分型夹心ELISA分析Tau蛋白的结构特征
夹心ELISA结果表明，可溶性Tau蛋白呈现纸夹状构象（paperclip-like structure），其N端和C端与微管结合重复区（Microtubule-Binding Domain, MTBD）发生相互作用。磷酸化和纤维化会破坏这种长程相互作用，导致重复区和C端的屏蔽。捕获抗体9H6F2、ADx201或ADx202（靶向P2区）能够有效解除R1区的屏蔽，提示这些表位在Tau构象调控中具有重要作用。
16B12检测特异性Tau构象
通过肽吸收实验和蛋白酶K（Proteinase K, PK）消化实验，证实16B12识别由R1（249PMPDLKN255）和R3（309VYKPVDLpSKVTpSKCGpSLG326）区形成的不连续构象表位。竞争性IHC显示16B12与MC1抗体部分表位重叠，但16B12识别的构象变化发生于更早期。
mAbs在AD中的诊断潜力
IHC分析显示，多种mAb（如9H6F2、16B12等）在早期Braak分期（I–III期）即可检测到神经毡线程和神经原纤维缠结，其灵敏度与AT8相当，且高于MC1。在非AD病例中，这些抗体未检测到类似病变，证实其特异性。
构象特异性mAb 16B12检测AD Tau病理早期结构成熟过程，涉及R1模糊区
比较分析表明，16B12在Braak I期即能检测到Tau病变，早于MC1。免疫印迹和ELISA滴定实验进一步证实，16B12在早期AD脑组织提取物中即可识别Tau聚集体，且灵敏度高。这表明R1区在Tau纤维成熟早期即被整合到C端核心中。
mAbs在其他脑Tau蛋白病和PReT中的诊断潜力
在AGD、PSP、CBD、PiD等Tau蛋白病中，9H6F2和16B12等抗体能有效检测各类病理病变（如预缠结、线圈状小体、Pick小体等）。在PReT中，16B12在病变早期（0期和1期）即可检测到视网膜各层的Tau构象变化，而MC1则为阴性，提示16B12在非脑性Tau蛋白病中同样具备早期诊断价值。
16B12在AD中的成核和种子抑制效应
ThT动力学分析显示，16B12以剂量依赖的方式抑制rTau的聚集。在Tau生物传感器细胞实验中，16B12能显著降低AD脑源性Tau种子的延伸效率，而其他mAb无此效应。这表明16B12通过靶向R1-R3相互作用，干扰了Tau的病理聚集过程。
研究结论与讨论部分强调，该研究通过系统性抗体分析，揭示了R1重复区与R3区PHF6基序（aggregation-prone region, APR）的相互作用是Tau病理发生中的早期关键事件。构象特异性抗体16B12能识别这一结构特征，在多种Tau蛋白病（包括AD、CBD、PSP、PiD等）及PReT的早期阶段检测到Tau构象变化，并有效抑制体外Tau聚集和种子延伸。相比之下，9H6F2抗体虽具备广谱诊断潜力，但无治疗抑制作用。这些发现不仅深化了对Tau病理机制的理解，也为开发早期诊断工具和靶向免疫疗法提供了新的分子探针。未来研究可进一步探索16B12在动物模型中的治疗效果，以及其表位在各类Tau蛋白病中的保守性，推动精准医疗策略的发展。
