《Responsive Materials》：Refining responsive antimicrobial nanomaterials from random peptide libraries via machine learning
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本综述创新性地提出了一种结合机器学习与共组装行为的优化框架，成功将广谱随机肽混合物（RPMs）转化为结构明确、低成本的抗菌肽（AMPs）鸡尾酒疗法。研究通过量化RL0.5的抗菌活性与自组装特性，利用机器学习筛选关键功能肽，并基于协同作用与共组装行为优选复合物AEP，最终获得体外活性提升四倍、临界聚集浓度（CAC）更低的RL10。该工作为从复杂前体开发高效共组装抗菌制剂提供了可解释的设计路径，对推动抗菌肽工业化具有重要意义。
1 引言
抗菌耐药性（AMR）已成为全球公共卫生的重大威胁，2019年约495万死亡病例与AMR相关，其中127万为直接致死原因。传统抗生素的滥用加剧了耐药性风险，亟需开发低耐药倾向、低毒性的替代方案。抗菌肽（AMPs）因其广谱活性、膜靶向机制和低毒性被视为理想候选，但合成成本限制了其工业化应用。随机肽混合物（RPMs）虽成本较低，但存在活性有限、成分不明确、内部相互作用不清等问题。本研究通过整合机器学习与共组装策略，建立了一种从RPMs中提炼明确抗菌肽鸡尾酒的新方法。
2 材料与方法
2.1 材料
实验使用Mueller-Hinton Broth（MHB）培养基、磷酸盐缓冲液（PBS）及ANS、NPN、DiSC3-5等荧光探针。肽段通过固相合成法制备。
2.2 抗菌活性与自组装表征
采用微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度（MIC）。通过ANS荧光法分析临界聚集浓度（CAC），透射电镜（TEM）观察自组装形貌。细菌凝集实验通过测定OD600值评估凝集效率。
2.3 作用机制研究
利用NPN探针检测外膜通透性，DiSC3-5评估膜电位变化，SYTO9/PI染色结合共聚焦显微镜（CLSM）观察膜完整性。扫描电镜（SEM）和TEM用于分析细菌形态变化。
2.4 动物实验
使用C57BL/6小鼠构建脓毒症和肠道感染模型，通过腹腔注射RL0.5（20 mg/kg）评估体内毒性及疗效。组织细菌载量、炎症因子及肠道菌群通过16S rRNA测序分析。
2.5 活性肽筛选
从RL0.5的1024种序列中，排除连续4个精氨酸（R）或5个亮氨酸（L）的序列，结合DBAASP数据库及机器学习分类器，筛选出高抗菌活性的AMP1–3和高凝集活性的EP1–3。
3 结果
3.1 RPMs的设计策略与抗菌活性
通过调控疏水氨基酸比例，合成Arg/Leu系列RPMs（RL0.1–RL0.7）。RL0.5对革兰阳性菌（如金黄色葡萄球菌）和革兰阴性菌（如大肠杆菌）均表现出最优抗菌活性，MIC为64 μg/mL。
3.2 RL0.5的细菌凝集与自组装特性
RL0.5可在4小时内凝集70%的大肠杆菌，其自组装形成直径约2.0 nm的球形纳米颗粒，CAC为20.0 μg/mL。自组装行为与抗菌活性密切相关。
3.3 RL0.5的抗菌机制
RL0.5通过破坏细菌外膜通透性（NPN实验）、引起内膜去极化（DiSC3-5检测）及导致胞质泄漏（CLSM和电镜验证）发挥杀菌作用。
3.4 生物相容性与稳定性
RL0.5在256 μg/mL浓度下未引起溶血，在肠液和血清中保持活性。FITC标记实验显示其可在肠道内滞留，提示潜在局部感染治疗价值。
3.5 体内安全性
小鼠腹腔注射RL0.5（10–40 mg/kg）5天后，未发现体重、器官重量、结肠长度或肝肾功能指标（ALT、BUN等）异常，组织病理学未见损伤。
3.6 体内治疗效果
在脓毒症模型中，RL0.5处理组肝脏、脾脏、肺和肾脏的细菌载量降低0.9–1.5 log10，并缓解组织损伤。肠道感染模型中，RL0.5下调炎症标志物CD86、NF-κB，上调紧密连接蛋白ZO-1，且通过调节菌群（如增加Muribaculaceae丰度）恢复肠道稳态。
3.7 活性成分提炼与RL10设计
从RL0.5中筛选出AMP1（LRRLLRLLLR）、AMP2、AMP3及EP1–EP3。其中AMP1+EP2+EP3（AEP）表现出协同抗菌效应（FIC指数<0.5），并可共组装形成纳米网络结构。基于AEP特征设计的RL10（RR(RL)(RL)L(RL)(RL)LRL）对大肠杆菌的MIC降至16 μg/mL，CAC为16.9 μg/mL，活性较RL0.5提升四倍。
4 讨论
本研究通过平衡Arg/Leu比例优化RPMs活性，并首次系统阐明RL0.5的膜靶向机制与自组装特性。体内实验证明其兼具抗菌与免疫调节功能，且通过机器学习驱动的成分提炼，成功将复杂RPM转化为高效明确的抗菌制剂RL10。该策略为抗菌肽的工业化提供了可解释的设计范式。
5 结论
RL0.5在感染模型中展现治疗潜力，而通过活性成分提炼获得的RL10显著提升体外抗菌效能。本研究为开发低成本、高效能的抗菌肽鸡尾酒疗法提供了新思路，未来将致力于构建自动化筛选管道以推动AMP产业化。
