《Sensors & Diagnostics》：Wearable enzyme-free glucose sensor using a flexible sericin-based conductive bio-composite
引言
随着人们对健康监测需求的日益增长，新型皮肤生物传感器近年来受到广泛关注并快速发展。在各类生物传感器中，电化学传感器能够检测汗液中的生理成分并将其转化为电信号，用于生命指标监测，已成为研究热点。糖尿病等疾病可通过分析汗液葡萄糖水平进行监测。汗腺分布于全身，汗液可连续无创采集，相较于其他体液更具便利性。传统的指尖采血检测具有侵入性且引起不适，凸显了对汗液基柔性皮肤传感器等更无创、用户友好型方法的迫切需求。
柔性皮肤传感器通常由生物相容性材料制成，有助于减少皮肤刺激。此外，利用天然、可生物降解且无毒的材料可制备一系列环保型生物传感器。丝胶蛋白（SS）是一种从蚕茧中提取的天然蛋白质，具有良好的生物相容性、低毒性和环境友好性。其含有多种可修饰的化学基团，如羧基、氨基和羟基，在电化学检测方面潜力巨大。羟丙基甲基纤维素（HPMC）是一种水溶性、生物相容性的增稠剂，具有优异的成膜能力。其可被高碘酸盐选择性氧化生成双醛羟丙基甲基纤维素（DHMC）。丝胶蛋白与DHMC交联理论上可改善其机械性能并拓宽其应用潜力。因此，本研究选择丝胶蛋白和DHMC作为原材料制备柔性生物复合膜。
提高生物传感器的导电性也至关重要。氨基化多壁碳纳米管（AMWCNTs）因其强催化活性而被广泛应用。当用金属纳米颗粒修饰时，AMWCNTs为葡萄糖氧化提供了丰富的催化位点，且毒性极小，非常适用于无酶葡萄糖检测。用金纳米颗粒（AuNPs）修饰AMWCNTs可进一步增强导电性、分散性和热稳定性。
在本工作中，我们通过结合丝胶蛋白（SS）、DHMC和AuNPs–AMWCNTs开发了一种柔性生物复合膜，以实现优异的生物相容性和无酶葡萄糖检测的电催化性能。希夫碱交联反应确保了强大的结构完整性，而AuNPs–AMWCNTs网络增强了电子转移和催化效率。该薄膜进一步集成到丝网印刷电极上，构建了一个用于实时汗液葡萄糖监测的可穿戴平台。该策略为连续、无创的葡萄糖传感提供了一种可持续且可靠的方法，在个性化健康管理方面具有广阔前景。
材料与方法
材料和仪器
蚕茧购自中国重庆当地的养蚕场。羟丙基甲基纤维素（HPMC）购自天津广复精细化工研究所。高碘酸钠（NaIO4）和氯金酸（HAuCl4·3H2O）购自上海阿达玛斯-beta有限公司。氨基化多壁碳纳米管（AMWCNTs，纯度>95%）购自南京先丰纳米材料科技有限公司。所有其他化学品均为分析纯，未经进一步纯化直接使用。
细胞荧光成像使用尼康Eclipse Ti-U倒置荧光显微镜进行。材料表面形貌和元素组成使用日立SU8010场发射扫描电子显微镜结合牛津仪器X-MaxN能量色散X射线光谱仪进行表征。X射线衍射（XRD）图谱使用布鲁克D8 ADVANCE衍射仪获得。傅里叶变换红外（FTIR）光谱在尼高兰iS50光谱仪上收集，波长范围为400至4000 cm?1。电化学测试采用三电极系统，包括导电复合膜作为工作电极（上海CHI660E）、Ag/AgCl（饱和KCl）参比电极和铂丝对电极。所有仪器在使用前均根据制造商的标准化规程进行校准。
传感器的制备
SS–DHMC复合基底的合成
蚕茧经高压蒸汽（121 °C, 20 min）处理提取丝胶蛋白（SS）。提取的SS经冷冻干燥获得纯化的SS粉末。DHMC通过NaIO4氧化法合成：将4% (w/v) HPMC与5.28% (w/v) NaIO4在pH 3.5、40 °C下反应5小时。产物经透析并在50 °C下干燥。进行化学交联时，将DHMC (0.05 g)溶解于2 mL超纯水中，制成2.5% (w/v)溶液。将SS粉末 (0.05 g)加入该溶液中，混合物在60 °C下搅拌1小时，形成3D希夫碱网络。
AuNP–AMWCNT纳米复合材料的合成
AuNP–AMWCNT纳米复合材料的制备基本参照Chen等人的方法。将AMWCNTs (10 mg)分散在10 mL 3%柠檬酸钠溶液中，混合物经超声处理后煮沸。向混合物中加入5 mL 1% HAuCl4，直至出现酒红色。产物经离心洗涤获得AuNPs–AMWCNTs。
SS–DHMC–AuNPs–AMWCNT传感器的组装
AuNPs–AMWCNTs的含量以v/v报告，定义为储备分散体在浇铸混合物中的体积分数。初步筛选表明，含量低于5%时渗透不足且氧化还原响应弱，而高于20%时则浆料粘度高、局部团聚且薄膜完整性差。因此，选择5–20%作为实际优化窗口。将足量的AuNPs–AMWCNTs混合到SS–DHMC溶液中，使其浓度达到5–20% (v/v)，混合物磁力搅拌12小时。将混合物浇铸到聚二甲基硅氧烷模具上，在40 °C下干燥，并剥离成自支撑薄膜 (1 × 1 cm2)用于电化学测试。
生物相容性评价
细胞毒性试验
L929细胞和HeLa-RFP细胞在含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中，于37 °C、5% CO2条件下培养。在存在薄膜样品 (0.3 × 0.3 cm2)的条件下培养24小时后，进行CCK-8测定。在450 nm波长下测量吸光度。
组织学分析
斯普拉格-杜利大鼠在皮下植入复合薄膜样品前适应环境1周。植入后第7天，处死大鼠并采集主要器官。组织切片 (5 μm) 用苏木精和伊红 (H&E) 染色以评估炎症反应。所有动物程序均按照重庆医科大学实验动物护理和使用指南进行，并得到机构动物伦理委员会批准。
导电复合薄膜的电化学表征
在0.1 mM pH = 7.0的PBS溶液中，使用循环伏安法 (CV) 从-0.55 V至0.65 V，扫描速率100 mV s?1，检测不同薄膜的复合膜面积 (1 cm × 1 cm) 的电化学性能；并在含有0.5 mM [Fe(CN)6]3?/4?的0.05 M KCl溶液中进行电化学阻抗谱 (EIS) 测试。在静止溶液中，进行差分脉冲伏安法 (DPV) 和CV的线性测试。使用DPV法检测几种干扰化学物质。通过比较添加各种干扰物前后的电流值来评估抗干扰能力。
结果与讨论
SS–DHMC–AuNPs–AMWCNTs的物理和化学表征
采用多种表征技术的综合分析可以揭示有关化学成分、微观结构、晶体结构和元素分布的关键信息。本研究通过对SS–DHMC–AuNPs–AMWCNT复合薄膜进行系统表征，以验证材料的制备成功，并为其性能优势提供理论基础。
首先，通过FT-IR光谱分析了复合薄膜的交联状态。HPMC经NaIO4氧化后，在1730 cm?1处出现了一个吸收峰，该峰在已报道的HPMC谱图中不存在。该峰归属于醛羰基振动，其存在与DHMC的形成一致。然而，SS–DHMC的吸收谱图在1730 cm?1处没有显示峰，表明醛基在SS存在下发生了化学反应。希夫碱C═N键的特征振动峰（约1660 cm?1）在SS–DHMC中未观察到，可能是由于被SS的酰胺I带（1600–1690 cm?1）所掩盖。交联后，SS–DHMC–AuNPs–AMWCNTs的FT-IR光谱与SS的二级结构从无规卷曲向α-螺旋的轻微转变一致。
XRD分析用于研究材料的晶体结构。SS–DHMC–AMWCNTs谱图中25.85°和42.6°处的峰归属于AMWCNTs的 (002) 和 (100) 晶面，而SS–DHMC–AuNPs–AMWCNTs新出现的衍射峰38.15°, 44.35°, 64.6°, 77.6°, 81.9°, 110.85°, 和115.3°分别归属于AuNPs的 (111), (200), (220), (311), (222), (331), 和 (422) 晶面。这些特征峰的出现证实了AuNPs–AMWCNTs的成功负载，并且表明存在大量高指数晶面，这可能增加了相对于游离AuNPs的表面能，从而增强了材料的反应性并有利于电化学检测。
接下来进行了SEM分析以研究复合薄膜的微观结构，因为微观结构是任何材料性能的关键。SS–DHMC–AuNPs–AMWCNT薄膜呈现出均匀的多孔结构，表明该材料具有相对较高的比表面积和高效的传质能力。微孔性还可能增加电化学活性位点的数量，极大地促进了后续的电化学检测。
元素定量分析证实，C、O和Au的比例符合预期，分别占材料总质量的19.52%、55.73%和23.82%，为复合材料的组成提供了定量证据。EDS mapping显示Au均匀分散在材料中，表明AuNPs没有显著聚集，大多数纳米颗粒直径为50 nm，进一步增加了多孔结构的表面积。
材料的稳定性是决定其作为柔性传感器基底实际应用性的关键因素。我们发现SS–DHMC–AuNPs–AMWCNT薄膜在水中浸泡后保持其结构完整性，没有明显的损伤或AuNPs脱落。这种稳定性可能源于SS和DHMC之间形成的共价交联网络，它提供了一个坚固的框架，以及AMWCNTs的掺入增强了材料的机械强度。此外，其在水中96小时后的溶胀率保持在2.15左右并趋于稳定，具有良好的稳定吸水性。
与传统的聚合物基复合材料相比，本工作制备的复合材料在保持明确结构的同时，表现出显著更好的稳定性。我们将这种改进主要归因于材料设计中采用的多级交联策略，因为已知希夫碱反应在分子水平上形成稳定的共价网络。此外，AuNPs–AMWCNTs与基质在纳米尺度上的相互作用进一步增强了结构稳定性。均匀分散的AuNPs不仅提供了丰富的活性位点，还可能通过与AMWCNTs的相互作用协同提高材料的导电性。
总之，系统表征证实了SS–DHMC–AuNPs–AMWCNT复合薄膜的成功制备，并为其结构-性能关系提供了重要见解。该材料表现出的优异稳定性为其在传感器技术中的实际应用，特别是需要长期稳定性的传感系统，奠定了坚实基础。
复合材料的生物相容性
生物相容性是评估生物医学材料潜在临床应用性的关键参数。在本研究中，我们通过体外细胞实验和体内动物实验系统地研究了SS–DHMC–AuNPs–AMWCNT复合材料的生物相容性。
在体外，与对照处理相比，SS–DHMC–AMWCNTs和SS–DHMC–AuNPs–AMWCNTs均表现出优异的细胞相容性。具体而言，荧光显微镜分析表明，与对照表面相比，HeLa细胞在两种复合材料表面的粘附细胞密度更高，并且粘附的细胞表现出明显正常的形态。当L929细胞在SS–DHMC–AMWCNTs和SS–DHMC–AuNPs–AMWCNTs存在下培养时，通过CCK-8测定发现相对于对照的增殖率分别为106.5%和109.4%。其他研究也观察到类似结果，其中微孔结构被证明是直接导致细胞粘附增加的原因。总之，这些结果表明无明显细胞毒性，并暗示材料的多孔结构可能促进细胞粘附和增殖。
为了评估由该材料制成的表皮生物传感器的潜在安全性，将三种复合薄膜（SS–DHMC、SS–DHMC–AMWCNTs和SS–DHMC–AuNPs–AMWCNTs）皮下植入大鼠背部皮肤。所有样品均在内毒素最小化条件下处理并在生物测试前灭菌。植入一周后，任何处理组均未观察到显著肿胀或炎症渗出。然而，虽然植入SS–DHMC和SS–DHMC–AMWCNTs的大鼠未显示明显的炎症反应，但植入SS–DHMC–AuNPs–AMWCNTs的大鼠在一周后表现出轻度的局部炎症细胞浸润。组织学分析显示，炎症细胞主要聚集在材料与组织的界面处，如H&E染色中蓝色区域所示，这可能是由于AMWCNTs刚性结构的机械刺激以及痕量活性氧的产生激活了免疫细胞。重要的是，这种炎症反应保持轻微，并处于生物材料植入时通常观察到的生理范围内。
该传感器旨在用于表皮短期（24小时）监测，表皮具有完整的角质层屏障，与真皮相比免疫细胞较少。因此，我们的结果表明该材料在表皮应用中表现出卓越的生物相容性。人体皮肤斑贴试验证实，SS–DHMC–AuNPs–AMWCNT薄膜贴敷48小时未引起皮肤刺激或过敏反应。因此，该材料的性能与商业无菌敷料相当，从而验证了其用于表皮生物传感的安全性并支持其临床潜力。目前的体内评估侧重于短期反应；未来的工作将评估更长期的降解/浸出物测试和表面工程变体，以进一步降低长期佩戴的炎症风险。
Kus-Li?kiewicz提出了一系列用于评估金纳米颗粒（AuNPs）细胞毒性和生物相容性的体外和体内测定方法；SS–DHMC–AuNPs–AMWCNT复合材料在表皮应用中表现出优异的生物相容性，满足了生物相容性的生物学要求。与先前报道的碳基纳米复合材料相比，该材料在生物相容性方面显示出显著优势。天然聚合物基质（SS–DHMC）构建的生物友好界面为细胞生长提供了最佳微环境，而通过工艺优化实现的纳米材料均匀分散避免了潜在刺激物局部高浓度引起的反应。这些优势的协同作用赋予复合材料可靠的安全性和稳定性，为其在医疗监测工具中的应用奠定了坚实基础。在未来的工作中，我们计划优化AMWCNTs的表面修饰，例如引入亲水基团或生物相容性涂层，以更全面地降低潜在的炎症风险，并扩展其在长期植入设备中的应用潜力。
在皮下模型中观察到的轻度局部浸润应根据传感器的短期表皮用途来解读，表皮完整的角质层限制了细胞暴露。为了进一步降低风险，未来版本将对纳米填料应用防污表面修饰（聚乙二醇化或两性离子涂层；聚多巴胺锚定的透明质酸/明胶/丝胶壳；AuNPs上的硫醇化PEG封端）和温和的氧化/酸功能化CNTs以改善亲水性。将探索抗氧化功能层（例如，聚多巴胺/单宁酸）以清除界面附近的ROS。关于降解，SS–DHMC基质预计会产生肽和纤维素衍生的片段，而金属/碳质填料基本上不溶；因此，我们的后续工作将强调浸出物测试（质量损失/FTIR，Au的ICP-MS，拉曼光谱检测CNT脱落），同时进行浸出物细胞毒性和巨噬细胞细胞因子测定以量化炎症潜力。
SS–DHMC–AuNPs–AMWCNTs的电化学性能
电催化机理与性能
我们进行了系统的电化学测试以研究SS–DHMC–AuNPs–AMWCNT复合薄膜的葡萄糖传感特性。传感机制主要依赖于两个关键组分的功能协同作用：AuNPs提供高效催化活性位点，而AMWCNTs构建三维导电网络以确保快速电子转移。在催化过程中，AuNPs表面形成的水合单层[Au(OH)ads]作为活性中心。它特异性地与葡萄糖分子的羟基相互作用，促进葡萄糖异头碳上氢原子作为质子的解离，同时释放电子生成葡萄糖酸内酯。该氧化过程产生的电子通过AMWCNTs建立的导电通路快速传输到电极表面，形成可检测的电信号。值得注意的是，AMWCNTs不仅作为电子传导介质，而且由于其大表面积显著增加了活性位点的负载能力。同时，SS–DHMC基质的亲水性促进了葡萄糖扩散和传质。这三个组分的协同相互作用被确定共同增强了传感器的检测性能。
差分脉冲伏安法（DPV）显示，SS–DHMC–AuNPs–AMWCNTs在0.07 V附近有一个明显的氧化峰，其电流响应显著高于SS–DHMC和SS–DHMC–AMWCNTs，证实了AuNPs在提高传感器灵敏度方面的关键作用。计时电流法（CA）进一步证明，SS–DHMC–AuNPs–AMWCNT复合薄膜在葡萄糖检测中表现出显著增强的电流响应。这种显著的催化增强效应凸显了AuNPs在电化学葡萄糖传感中的关键作用，为开发其他高性能生物传感器奠定了坚实基础。
基于Randles等效电路模型的电化学阻抗谱（EIS）分析进一步阐明了材料界面的电子转移特性。SS–DHMC–AuNPs–AMWCNTs的电荷转移电阻（RCT）为537.8 Ω，比SS–DHMC–AMWCNTs（709.5 Ω）低24.2%。该动力学结果证实了AuNPs的高导电性提供了额外的电子转移途径，同时与AMWCNTs形成的协同界面降低了界面能垒并促进了电子转移。支持检测器灵敏度的另一个因素是纳米复合材料的多孔结构有助于增加有效电极面积。
动力学分析
循环伏安法（CV）为了解材料的动力学行为提供了重要信息。SS–DHMC–AuNPs–AMWCNTs在添加2 mM葡萄糖后氧化还原峰电流显著增强，而对照材料没有这种响应，明确证实了AuNPs的催化作用。此外，SS–DHMC–AuNPs–AMWCNTs的CV曲线随着葡萄糖浓度在0至14 mM范围内的增加而逐渐变化，其中氧化和还原峰电流均与葡萄糖浓度呈线性关系，表明其具有定量检测能力。
为了阐明AuNPs在葡萄糖氧化中的电催化机理，我们系统地研究了SS–DHMC–AuNPs–AMWCNTs修饰电极在不同扫描速率（50–500 mV s?1）下的电化学行为。氧化峰电位随扫描速率增加而正移，还原峰电位负移，这是准可逆氧化还原系统的特征。值得注意的是，氧化峰电流与扫描速率呈强线性关系，证实了这是一个表面吸附控制过程，而非扩散控制过程。这种动力学特征突出了AuNPs表面位点的高效催化活性以及复合材料孔隙率对活性位点暴露的促进作用。动力学特性还表明传感器响应速度不受葡萄糖扩散限制，并且灵敏度可以通过表面积优化进一步
