《Macromolecular Bioscience》：Dynamic Gelatin Hydrogels Crosslinked by Dithiolane-Norbornene Click Chemistry
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本文报道了一种通过二硫戊环-降冰片烯（Dithiolane-Norbornene）点击化学交联的动态明胶水凝胶新策略。该平台将明胶-降冰片烯（GelNB）与聚乙二醇-四硫辛酸（PEG4LA）交联剂结合，在低光引发剂浓度（LAP）和温和光照条件（365 nm, 5 mW/cm2）下实现高效光交联。其独特优势在于可通过二次光照动态诱导二硫戊环开环，实时调控水凝胶刚度，为人诱导多能干细胞（hiPSCs）的3D封装、培养及定向分化（如定形内胚层）提供了高度仿生且可动态调节的细胞外基质（ECM）微环境，突破了传统静态水凝胶在模拟发育过程中力学动态变化方面的局限。
引言：动态细胞外基质微环境的工程化需求
人诱导多能干细胞（hiPSCs）在疾病模型构建和组织再生领域具有巨大潜力，因其具备分化为三胚层所有细胞类型的能力。然而，现有的hiPSC分化方案多聚焦于优化可溶性因子和二维基质涂层，往往忽略了细胞外基质（ECM）力学性能随时间动态变化的关键影响。在三维（3D）空间中，ECM会因胶原、透明质酸（HA）等分子的沉积而逐渐硬化，同时基质金属蛋白酶（MMPs）的表达上调又会导致基质降解和软化。这种基质刚度的动态变化能够触发细胞内信号传导，进而改变细胞命运进程。
传统的细胞培养底物，如组织培养塑料（TCP），虽然易于使用，但其超高的基底刚度（> GPa）缺乏生理相关性，且无法模拟动态的3D微环境。源自小鼠肉瘤基底膜的基质胶（Matrigel）虽广泛用于hiPSCs的培养和分化，但其肿瘤来源、批次间差异大、生化成分不明确以及可调性有限等缺点限制了其转化应用前景。这些不足促使研究者将目光投向化学交联的生物材料支架，以期实现对基质力学性能和重现性的更好控制。
水凝胶基质可通过交联获得理想的生物物理和生化特性，从而模拟天然ECM的特性。例如，化学交联的明胶水凝胶已广泛应用于组织工程和再生医学。明胶源自变性的胶原蛋白，含有多种整合素结合基序（如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，RGD）和蛋白酶可裂解序列。然而，明胶具有高于室温的上临界溶解温度（UCST），需要在体温下进行化学修饰以实现稳定交联。
明胶-甲基丙烯酰化（GelMA）可通过链增长光聚合交联，但其链增长过程会产生高浓度自由基，对敏感细胞类型可能造成损伤。作为替代方案，逐步增长聚合的水凝胶，如通过正交硫醇-降冰片烯点击化学交联的明胶-降冰片烯（GelNB）水凝胶，能够以更低的光引发剂浓度实现高效交联，具有反应动力学快、细胞相容性高等优点。尽管GelMA和GelNB各有优势，但它们分别形成的聚甲基丙烯酸酯和硫醚键是非动态的，限制了其在动态水凝胶领域的应用。
为解决这一局限，研究者们开发了多种具有动态可调特性的明胶基水凝胶，包括可通过正交点击反应、酶促反应、光反应或动态共价化学（DCC）进行硬化的水凝胶。然而，这些方法通常需要对明胶进行双重修饰以实现初级凝胶交联和次级硬化的正交控制。动态共价化学（DCC）为动态调控凝胶性能提供了另一种途径，其中二硫戊环介导的开环聚合（ROP）是制备动态水凝胶的一种新兴DCC。
材料与方法：动态水凝胶的构建与表征
本研究报道了一种用于hiPSCs培养和定形内胚层（DE）分化的、具有按需可调力学性能的明胶基二硫戊环-降冰片烯水凝胶系统的开发与表征。通过将GelNB与四臂聚乙二醇-硫辛酸（PEG4LA）在温和反应条件下共聚，成功实现了3T3成纤维细胞和hiPSCs的安全光封装。此外，通过光诱导的二硫键交换对载有细胞的GelNB/PEG4LA水凝胶进行动态硬化，使得研究动态力学变化对干细胞行为的影响成为可能。
GelNB的合成参照已发表的方法略有修改，使用三乙胺（TEA）作为碱催化剂，与明胶上的伯胺反应，实现了约90%的降冰片烯修饰度（约5.4 mM NB/wt% 明胶）。PEG4LA则通过将四臂聚乙二醇-胺（PEG4NH2）与硫辛酸（LA）在偶联剂HATU存在下反应制备而成。
水凝胶前体溶液在疏水处理的载玻片之间浇铸成型，通过光照射（365 nm, 5 mW/cm2，2分钟）进行光交联。采用原位光流变仪评估聚合动力学，通过应变扫描、频率扫描和应力松弛测试来表征水凝胶的刚度、线性粘弹性区域（LVR）和粘弹性。动态硬化通过将软凝胶在含有不同浓度LAP或PEG4LA的缓冲液中孵育后，进行二次光照来实现。酶降解实验通过将成型水凝胶在I型胶原酶（100 U/mL）中孵育，并监测质量损失来进行。
对于细胞实验，GFP转染的小鼠胚胎成纤维细胞（3T3-GFP）和ChiPSC12 hiPSCs被封装在GelNB/PEG4LA水凝胶中。细胞-水凝胶复合物在培养基中培养，并通过活/死染色、F-肌动蛋白（F-actin）染色和免疫荧光染色评估细胞活力、形态和分化情况。定形内胚层分化使用商业试剂盒进行，并通过qRT-PCR和免疫染色分析DE标志物（SOX17, FOXA2）的表达。
结果与讨论
合成与交联：GelNB/PEG4SH与GelNB/PEG4LA水凝胶的对比
首先评估了GelNB与四臂聚乙二醇-硫醇（PEG4SH）通过标准硫醇-降冰片烯光聚合进行交联的效果。增加光引发剂LAP浓度（1–2 mM）可加速凝胶化，凝胶点（储能模量G‘超过损耗模量G″的时间）从约20秒缩短至约10秒。所有水凝胶前体含有相同量的GelNB和PEG4SH（各5% w/v），最终均能达到约8 kPa的储能模量。
为了赋予GelNB水凝胶动态可调的特性，使用含有二硫戊环的PEG4LA替代PEG4SH作为交联剂。然而，纯二硫戊环ROP通常需要高聚合物浓度、长光照时间或高光强，这与原位细胞封装不兼容。实验发现，在无LAP情况下，5% w/v PEG4LA前体在温和光照下（2分钟）无法形成凝胶。即使添加1 mM LAP，PEG4LA的凝胶化也非常缓慢（凝胶点约490秒）。提高光强（10至20 mW/cm2）可加速交联，但高浓度LAP（5和10 mM）会导致因二硫键持续断裂和自由基终止而引起的反向凝胶化（凝胶降解）。
将GelNB与PEG4LA混合后，即使在无光引发剂情况下，凝胶化也因降冰片烯中的烯键参与二硫戊环ROP而加速（凝胶点缩短至约360秒）。加入1 mM LAP可进一步将凝胶点加速至约60秒。增加LAP浓度至2 mM，凝胶点可缩短至10秒。在相同的硫醇总浓度（20 mM SH）下，由PEG4LA交联的GelNB水凝胶比由PEG4SH交联的水凝胶更软，这可能是由于PEG交联剂分子量差异（PEG4SH为10 kDa，PEG4LA为20 kDa）或在短时间凝胶化内ROP不完全所致。应力松弛测试表明，两种水凝胶在1000秒内均表现出有限的应力松弛，表明其网络结构更具弹性。
动态硬化与软化：力学性能的可逆调控
利用PEG4LA中的二硫键，可以调节GelNB/PEG4LA水凝胶的交联密度。额外的光照（不添加任何引发剂或大分子）会导致二硫戊环-降冰片烯水凝胶的刚度逐渐增加，在740秒内，25°C和37°C下分别导致G‘增加约2倍和3倍。这归因于凝胶化后额外的二硫键ROP。
对由1 mM LAP交联的GelNB/PEG4LA水凝胶（初始G’ ～ 1 kPa）进行动态硬化评估。将水凝胶在含有LAP（2.5, 5, 7.5 mM）的缓冲液中孵育后，进行二次光照，其模量几乎瞬时增加。模量的变化倍数与外加LAP含量呈正相关。同样，在固定LAP浓度（7.5 mM）下，硬化程度也与外加PEG4LA含量正相关，添加10% w/v PEG4LA可使模量增加约18.2倍（从～1 kPa增至～18 kPa）。这种显著的刚度增强凸显了该凝胶系统的动态调谐能力。
接下来评估了水凝胶的软化。通过添加LAP、谷胱甘肽（GSH）和光照试图诱导软化。然而，光照初期观察到的是硬化而非软化，随后才出现GSH浓度依赖性的模量缓慢降低。这表明光诱导的硫醇-二硫键交换事件与导致软化的GSH-硫基自由基结合事件之间存在竞争。使用硫醇-free的二硫键还原剂TCEP（三(2-羧乙基)膦）处理水凝胶19小时后，由1 mM LAP交联的水凝胶模量降低了约54%，表明网络中约一半的交联点来自二硫键，另一半来自硫醚键。而由更高浓度LAP（5和10 mM）交联的更硬水凝胶，经TCEP处理后模量下降幅度较小（约25%-30%），表明这些凝胶网络中二硫键相对于硫醚键的比例较小。
3T3成纤维细胞在动态水凝胶中的3D培养
蛋白酶介导的水凝胶降解特性分析显示，在相同蛋白酶可裂解GelNB含量（5% w/v）下，PEG4LA交联的二硫戊环-降冰片烯水凝胶比PEG4SH交联的硫醇-降冰片烯水凝胶降解更慢。这表明两种凝胶可能具有不同的网络连通性（PEG4SH每分子4个官能团，PEG4LA每分子8个官能团）。
将3T3细胞封装在GelNB/PEG4LA水凝胶中，活/死染色结果显示在对照组和硬化组中均具有优异的细胞相容性。在7天的培养过程中，软水凝胶支持3T3细胞形成互连的纺锤状形态，而硬化后的水凝胶则限制了细胞的铺展。定量分析表明，软凝胶中的细胞铺展面积分数（area fraction）在7天后达到约35%，而硬化凝胶中的细胞铺展较慢，面积分数约为10%。这一观察结果与先前的研究一致，即软水凝胶相比硬水凝胶或动态硬化水凝胶更能促进细胞铺展。
hiPSC在动态水凝胶中的培养与分化
研究表明，较高刚度（弹性模量E ～ 6–7 kPa，或储能模量G’ ～ 2.5 kPa）的水凝胶促进内胚层分化。在本研究中，ChiPSC12细胞在GelNB/PEG4LA水凝胶（G‘ ～ 1 kPa）中封装后活力很高，并在7天培养期内形成较大的细胞团。在培养第2天通过添加LAP（2.5 mM）和光照进行动态凝胶硬化，并未降低细胞活力，但减小了细胞团的大小。软凝胶和动态硬化水凝胶中细胞团的平均直径分别为约40 μm和约62 μm，且硬化凝胶中的细胞团尺寸分布更集中。
无论水凝胶硬化条件如何，hiPSCs均保持了与2D培养相当的多能性，通过qPCR检测多能性标志物（OCT4A, SOX2, NANOG）得到证实。随后，使用商业试剂盒进行定形内胚层分化。分化第4天（即硬化后2天）开始，持续2天。免疫染色显示SOX17的显著表达，证实了水凝胶内成功的DE分化。qPCR分析进一步显示，在硬化凝胶中，多能性标志物OCT4A表达下调，而DE标志物SOX17的表达则显著高于软凝胶。
结论
传统的明胶基水凝胶缺乏动态可调特性，除非对明胶进行多重修饰。本研究通过结合GelNB和PEG4LA解决了这一问题，两者合成简单，但交联后形成了细胞响应性高、动态性强的基质。然而，与传统的GelNB/PEG4SH硫醇-降冰片烯水凝胶不同，GelNB/PEG4LA二硫戊环-降冰片烯凝胶对蛋白水解的敏感性较低，可能是由于凝胶中形成的多重二硫键存在空间位阻。此外，GelNB/PEG4LA中的二硫键连接不能轻易解交联，其潜在机制有待进一步研究。尽管如此，本研究证明了GelNB/PEG4LA水凝胶在hiPSCs的原位培养和DE分化方面具有优异的细胞相容性。未来的工作将利用GelNB/PEG4LA水凝胶的动态硬化能力，探索力学调控在干细胞命运决定中的作用，并扩展该系统以构建支持并增强iPSC衍生细胞分化的生物制造结构。
