中脑导水管周围灰质星形胶质细胞调控小鼠防御性及恐慌样行为的机制研究

《Advanced Science》：Midbrain PAG Astrocytes Modulate Mouse Defensive and Panic-Like Behaviors

本研究首次揭示中脑导水管周围灰质（PAG）星形胶质细胞通过钙离子（Ca2+）活性升高及三磷酸腺苷（ATP）释放，动态调控小鼠对威胁刺激的防御行为（如冻结、逃跑）；异常激活可诱发类似恐慌症（panic-like）的适应不良行为。成果为解析恐慌相关疾病的神经生物学基础提供了新靶点。

　　

1 引言

防御行为是动物应对威胁环境的核心生存策略，其神经功能失调可能导致恐慌样行为。中脑导水管周围灰质（PAG）作为整合威胁信息的关键脑区，调控冻结、逃跑等防御反应，但其在恐慌样行为中的细胞机制尚不明确。传统研究聚焦于PAG神经元的功能，而星形胶质细胞作为三重突触的重要组成部分，能否通过钙活动（Ca²⁺）及胶质递质释放调节防御行为，是本研究的核心科学问题。

2 结果

2.1 PAG星形胶质细胞Ca²⁺活性在威胁情境下升高

通过时间相关单光子计数（TCSPC）光纤记录技术，发现小鼠暴露于狐狸气味（TMT）、手部攻击或遥控车（RC car）等威胁刺激时，PAG星形胶质细胞的Ca²⁺信号显著增强（图1b,d,f）。双光子成像进一步显示，86.8%的PAG星形胶质细胞在狐狸气味刺激下出现Ca²⁺响应（图1l–n）。相反，非威胁性刺激（如雌鼠或新物体）未引发Ca²⁺活动变化（图1g–j），表明PAG星形胶质细胞特异性参与威胁感知。

2.2 PAG星形胶质细胞为优化防御反应所必需

通过药理性损毁星形胶质细胞（L-AAA注射）或特异性抑制其Ca²⁺活性（hPMCA2w/b表达），小鼠在听觉恐惧条件反射、狐狸气味暴露及攻击逃避任务中的冻结行为减少，逃跑速度下降（图2e–i,o–s）。这些干预不影响小鼠基础运动能力或非威胁情境下的探索行为（图2j–m），证实PAG星形胶质细胞精准调控防御行为而非普遍行为状态。

2.3 光遗传激活PAG星形胶质细胞诱发防御样行为

在hGFAP-ChR2转基因小鼠中，蓝光刺激PAG星形胶质细胞可引发冻结、逃跑、撤退及摇尾等防御样行为（图3d–k）。此类行为在光刺激期间持续出现，且以冻结反应为主导（图3l–m）。通过黑视蛋白（melanopsin）激活G蛋白通路模拟生理性Ca²⁺信号，同样可诱导类似行为（图S6e–h），排除了通道蛋白（ChR2）人工效应的干扰。

2.4 PAG星形胶质细胞激活破坏安全导向行为

在设有庇护所（shelter）的威胁环境中，光遗传激活PAG星形胶质细胞显著延迟小鼠逃避遥控车攻击的反应时间（图4b,c），并伴随防御行为的异常增加（图4d–g）。这表明星形胶质细胞过度活动会干扰目标导向的安全寻求行为，模拟恐慌症中的适应不良反应。

2.5 星形胶质细胞活动拮抗PAG神经元介导的逃避行为

联合激活PAG谷氨酸能神经元（CamKII⁺）与星形胶质细胞时，神经元原本促发的快速逃避行为被抑制，转为以冻结为主的被动反应（图4i–p）。而抑制性神经元（mDlx⁺）激活未产生显著逃避效应，且星形胶质细胞的调控作用仍占主导（图4q–t）。电生理记录进一步显示，星形胶质细胞释放的ATP可增强兴奋性神经元的微小兴奋性突触后电流（mEPSC），该效应可被嘌呤受体拮抗剂（PPADS）阻断（图7c–e）。

2.6 PAG星形胶质细胞参与CO₂诱导的恐慌样行为

暴露于恐慌原性刺激（CO₂或狐狸气味）时，小鼠出现无目的跳跃（panic-related jumping）及逃避失败，同时PAG星形胶质细胞Ca²⁺活动异常升高（图5a–g）。抑制星形胶质细胞活性（L-AAA或hPMCA2w/b）可减少跳跃行为，恢复小鼠通过绳索逃离CO₂环境的能力（图5j–u）。

2.7 ATP释放是星形胶质细胞调控行为的关键介质

微透析及GRAB传感器记录显示，光遗传激活PAG星形胶质细胞或CO₂暴露均引起细胞外ATP水平上升（图6a–c）。利用Opto-vTrap抑制囊泡胶质递质释放后，ATP水平及恐慌样行为均显著减弱（图6d–g）。嘌呤受体拮抗剂（PPADS）预处理亦可阻断光遗传诱导的冻结行为（图6l–n），证实ATP-嘌呤受体通路在行为调控中的必要性。

3 讨论

本研究首次实现在体记录PAG星形胶质细胞Ca²⁺动态，并确立其通过ATP释放调控防御行为选择（冻结vs.逃跑）的因果关系。异常星形胶质细胞活动可能通过破坏PAG局部兴奋-抑制平衡（如增强谷氨酸能输入），导致防御行为失控及恐慌样表型。未来需进一步解析ATP作用于神经元的具体受体亚型（如A1R、P2X/Y），并探讨性别因素对星形胶质细胞功能的调节。这些发现为恐慌障碍的靶向治疗提供了新思路。

4 材料与方法

实验使用6–16周龄雄性C57BL/6J及GFAP-CreERT2小鼠，通过立体定位注射病毒（AAV-GfaABC₁D-GCaMP6f、hPMCA2w/b等）及植入光纤，结合TCSPC、双光子成像、电生理、行为学（恐惧条件反射、开放场、高架十字迷宫等）和生化分析（Western blot、微透析）等多技术手段，验证星形胶质细胞在防御行为中的功能。数据以均值±标准误表示，采用t检验、ANOVA等统计方法分析显著性（p< 0.05）。