《Advanced Science》：Disengaging the Engine: Histone Deacetylases 1 and 2-Mediated Acetylation of Hexokinase-2 Regulates Energy Metabolism in Microglia Following Intracerebral Hemorrhage
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本研究揭示了组蛋白去乙酰化酶1和2（HDAC1/2）通过乙酰化修饰己糖激酶2（HK2）调控脑出血（ICH）后小胶质细胞代谢重编程的新机制。研究发现，抑制HDAC1/2可促进HK2第866位赖氨酸（K866）乙酰化，抑制糖酵解，促进脂肪酸氧化（FAO），从而减轻神经炎症、增强吞噬功能，改善神经功能缺损。该发现为靶向代谢免疫调控治疗ICH提供了新策略。
2.1 HDAC1/2基因敲除改善脑出血后长期神经功能障碍
通过立体定向注射自体血建立自发性脑出血小鼠模型。免疫荧光染色显示，脑出血后第3天，血肿周围小胶质细胞中HDAC1和HDAC2表达显著增加。利用他莫昔芬诱导的小胶质细胞特异性HDAC1/2基因敲除小鼠模型，研究发现HDAC1/2敲除可显著改善脑出血后小鼠的运动功能，表现为转棒实验停留时间延长、足误率降低、悬线实验表现提升。莫里斯水迷宫实验表明，HDAC1/2敲除缓解了脑出血诱导的长期记忆和认知缺陷，平台区域穿越次数增加。动态T2加权MRI扫描显示，HDAC1/2敲除显著加速了血肿清除。
2.2 HDAC1/2基因敲除保护脑出血后白质结构和功能完整性
脑出血35天后，评估白质结构和功能。神经元核抗原（NeuN）染色显示，HDAC1/2-miKO-ICH组血肿周围神经元数量显著改善。髓鞘碱性蛋白（MBP）和神经丝重链（NF-H）免疫荧光染色表明，HDAC1/2敲除显著改善了血肿周围髓鞘的保存。SMI-32（轴突变性标记物）染色显示，HDAC1/2抑制降低了平均荧光强度，表明脱髓鞘得到缓解。扩散张量成像（DTI）扫描和神经纤维束追踪分析显示，HDAC1/2敲除减轻了脑出血诱导的神经纤维束丢失，血肿周围区域各向异性分数（FA）值增加。电生理实验记录胼胝体复合动作电位（CAPs），发现Romidepsin（HDAC1/2抑制剂）处理部分恢复了N1和N2振幅，表明白质功能改善。
2.3 HDAC1/2抑制促进小胶质细胞中HK2 K866乙酰化
多组学测序（转录组、蛋白组、乙酰化修饰组）结果显示，HDAC1/2抑制剂Romidepsin处理显著改变了小胶质细胞的乙酰化修饰水平。差异乙酰化蛋白富集分析表明，HDAC1/2抑制主要影响糖酵解、三羧酸循环（TCA循环）和凋亡等生物学过程和KEGG通路。值得注意的是，HDAC1/2抑制导致关键糖酵解酶己糖激酶2（HK2）的第866位赖氨酸（K866）乙酰化水平显著增加。平行反应监测（PRM）技术验证了HDAC1/2抑制后小胶质细胞中HK2 K866位点乙酰化增加。HK2氨基酸序列在小鼠、大鼠和人类中高度保守。基序分析显示，HK2的K866乙酰化位点周围富含碱性和疏水性氨基酸。质谱分析鉴定出可能与HK2 K866位点乙酰化调控相关的乙酰转移酶（如KAT6A, KAT7, p300）和去乙酰化酶（如HDAC1, HDAC2, HDAC3）。
2.4 HDAC1/2基因敲除调控血肿周围小胶质细胞的功能表型
转录组分析显示，Romidepsin处理显著降低了BV2小胶质细胞的促炎M1表型相关基因（如Tnf-α, Nfkb1, Il6, Il1a, Fcgr3, Fcgr2b）表达，并上调了抗炎M2表型相关基因（如CD209, Il4, Il10, Cd163）。基因集富集分析（GSEA）表明，Romidepsin处理显著富集于LPS诱导的炎症反应下调、TGFβ1信号通路和经典补体激活通路。体内外实验证实，HDAC1/2-miKO显著降低了脑出血后第3天CD16+小胶质细胞的比例，但对Arg1+小胶质细胞无显著影响。Sholl分析显示，HDAC1/2敲除小鼠血肿周围小胶质细胞的分支增加，失去了阿米巴样变化。HDAC1/2敲除导致血肿周围小胶质细胞数量显著减少，其增殖（Ki67+/Iba1+和pH3+/Iba1+细胞）受到抑制，而吞噬相关基因表达上调。尽管单个小胶质细胞吞噬髓鞘碎片的能力增强，但由于小胶质细胞总数减少，各组间吞噬的髓鞘碎片总体积无显著差异。HDAC1/2敲除还增加了小胶质细胞中溶酶体标记物CD68的表达。
2.5 HDAC1/2抑制促进小胶质细胞从糖酵解向脂肪酸氧化的代谢转变
AlphaFold2结构预测显示，HK2 K866位点乙酰化导致其与底物结合口袋更加紧凑。酶活实验证实，HDAC1/2抑制或HK2 Kac866突变体过表达均显著降低HK2酶活性。Seahorse XF96代谢分析表明，Hemin刺激的BV2细胞基础糖酵解和最大糖酵解能力增强，而HDAC1/2抑制显著抑制了细胞外酸化率（ECAR）。HDAC1/2抑制降低了荧光葡萄糖类似物2-NBDG的摄取，增加了细胞内葡萄糖和乳酸水平。体内18F-FDG PET-CT成像显示，HDAC1/2敲除显著抑制了血肿周围细胞的18F-FDG摄取。非靶向代谢组学分析揭示，HDAC1/2抑制导致小胶质细胞代谢谱发生显著改变，差异代谢物主要富集于甘油磷脂代谢、TCA循环、不饱和脂肪酸生物合成和HIF-1信号通路。HDAC1/2抑制后，脂肪酸氧化相关酶（如Cpt1a, Acadm）表达上调，而脂质合成相关酶（如FASN, G6pdx）表达下调。GSEA分析显示，HDAC1/2抑制后小胶质细胞显著富集于脂肪酸氧化、线粒体长链脂肪酸β-氧化和细胞色素P450氧化通路。HDAC1/2抑制降低了细胞内脂质含量（Bodipy493/503荧光强度），减少了游离脂肪酸水平，同时增加了乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）含量。体内实验表明，HDAC1/2敲除减少了小胶质细胞中脂滴的积累。
2.6 HDAC1/2抑制导致小胶质细胞线粒体功能障碍和线粒体自噬
分子对接和免疫共沉淀实验表明，HK2 K866位点乙酰化削弱了HK2与线粒体膜通道蛋白VDAC1的结合。Seahorse线粒体压力测试显示，HDAC1/2抑制显著降低了小胶质细胞的基础呼吸、最大呼吸和ATP产生速率。HDAC1/2抑制加剧了线粒体膜电位崩溃（Mito-tracker深红平均荧光强度增加）和线粒体超氧化物积累（MitoSOX平均荧光强度增加）。Fluo4 AM染色显示HDAC1/2抑制显著增加了细胞内钙离子浓度。然而，HDAC1/2抑制导致细胞内ATP水平升高。转录组和蛋白组分析表明，HDAC1/2抑制显著上调了自噬相关标记物（如SQSTM1, LC3B）的转录水平。MDC染色和流式细胞术证实HDAC1/2诱导了自噬。Lyso-Tracker Red和Mito-Tracker Green共定位分析显示，HDAC1/2抑制增加了线粒体-溶酶体自噬。Ad-mCherry-GFP-LC3B病毒感染实验进一步证实，HDAC1/2抑制显著增加了线粒体内LC3B的表达。
2.7 HK2抑制调控小胶质细胞功能表型并减轻脑出血后神经功能缺损
使用HK2抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG）干预，模拟HK2酶活性减弱的效果。2-DG干预缓解了脑出血后小鼠的短期神经功能障碍，减少了急性期血肿周围小胶质细胞数量，抑制了小胶质细胞增殖活性（Ki67+小胶质细胞减少），并增加了小胶质细胞分支。2-DG干预显著抑制了血肿周围小胶质细胞的促炎表型（CD16表达降低），增加了Mertk的平均荧光强度和IL10+小胶质细胞的比例。另一种HK2抑制剂3-溴丙酮酸（3-BP）干预也表现出类似效果，降低了小胶质细胞增殖活性、促炎表型，并提高了Mertk表达。体外实验中，利用SgRNA敲除BV2细胞中的HK2基因，证实HK2敲除显著抑制了小胶质细胞的促炎表型，增强其抗炎表型和吞噬功能。HK2敲除同样诱导了细胞内钙离子浓度和线粒体超氧化物水平增加，并增强了自噬和线粒体自噬。利用重组AAV11载体在小胶质细胞中特异性过表达HK2，发现HK2过表达显著逆转了HDAC1/2缺陷小胶质细胞的表型，加重了脑出血后小鼠的运动功能障碍，并减慢了血肿清除速度。
3 讨论
本研究阐明了HDAC1/2在脑出血后通过调控小胶质细胞代谢和线粒体功能发挥关键作用。HDAC1/2敲除/抑制通过促进HK2 K866乙酰化，抑制糖酵解，增强脂肪酸氧化，诱导代谢重编程，从而抑制小胶质细胞增殖，减轻神经炎症，改善白质完整性，促进功能恢复。HDAC1/2抑制导致的线粒体功能障碍和增强的自噬/线粒体自噬进一步参与了小胶质细胞表型调控。靶向HDAC1/2-HK2轴为治疗脑出血提供了新的代谢免疫调控策略。
4 局限性
本研究存在一些局限性。首先，HDAC1/2抑制后小胶质细胞数量减少和炎症减轻的效应可能具有亚群特异性，尚不清楚其对不同小胶质细胞亚型的影响。其次，缺乏小胶质细胞特异性HK2基因敲除小鼠模型验证HK2的作用。第三，由于技术限制，未能利用Cut&Tag或ATAC-seq精确鉴定HDAC1/2调控的下游靶基因。此外，动物实验仅使用一种建模方法。
5 结论
本研究证明HDAC1/2通过乙酰化修饰HK2，调控小胶质细胞代谢重编程（从糖酵解转向脂肪酸氧化），抑制其增殖，减轻神经炎症，保护白质完整性，并促进脑出血后功能恢复。抑制HDAC1/2和HK2是治疗脑出血的潜在新靶点。
