瑞马唑仑通过抑制铁死亡改善自闭症模型小鼠VTA多巴胺神经元功能及行为异常

《Advanced Science》：Remimazolam Ameliorates Autistic-Like Behaviors via Suppression of Ferroptosis in VTA Dopaminergic Neurons in a Mouse Model of ASD

本研究首次发现超短效GABAA受体激动剂瑞马唑仑(remimazolam)可通过抑制腹侧被盖区(VTA)多巴胺神经元的铁死亡(ferroptosis)，显著改善丙戊酸(VPA)诱导的自闭症模型小鼠的社交障碍、刻板行为和焦虑样症状。该研究揭示了铁死亡在自闭症谱系障碍(ASD)发病机制中的关键作用，为开发新型ASD治疗策略提供了重要理论依据。

　　

瑞马唑仑通过抑制VTA多巴胺神经元铁死亡改善自闭症样行为的研究

引言

自闭症谱系障碍(ASD)是一种神经发育障碍，以社交功能障碍和刻板行为为核心特征，其发病机制与神经兴奋/抑制(E/I)失衡密切相关。近年来研究发现，腹侧被盖区(VTA)是调控ASD社交异常的关键脑区，其中多巴胺神经元占比高达60%。然而，关于VTA多巴胺神经元在ASD中的具体变化及其机制尚未明确。瑞马唑仑作为一种超短效GABA_A受体激动剂，除具有快速起效和代谢的特点外，近年研究发现其还能产生改善认知功能障碍等长效保护效应。

瑞马唑仑改善VPA暴露小鼠的自闭症样行为

研究采用VPA诱导的ASD小鼠模型，在出生后31-35天(P31-P35)每日腹腔注射15或30 mg kg^-1瑞马唑仑。行为学检测结果显示，瑞马唑仑能剂量依赖性地减少刻板行为，其中30 mg kg^-1剂量效果更为显著。在三室社交实验中，瑞马唑仑改善了VPA暴露小鼠的社交能力和社交偏好缺陷，且药物本身不增加社交活动。在高架十字迷宫和旷场实验中，瑞马唑仑同样显著改善了VPA暴露小鼠的焦虑样行为。

值得注意的是，单次腹腔注射瑞马唑仑可产生持续3-7天的治疗效果。其中，对社交新颖性的改善可持续约7天，而对社交偏好的改善持续约5天，在旷场和高架十字迷宫实验中的抗焦虑作用持续约3天。这种长效治疗效果与其超短效的药代动力学特征形成鲜明对比，提示其作用机制可能不依赖于经典的GABA能信号通路。

瑞马唑仑改善VTA多巴胺神经元损伤

为进一步验证瑞马唑仑通过VTA脑区发挥治疗作用，研究者在VPA暴露小鼠VTA脑区进行靶向注射。结果显示，VTA内注射瑞马唑仑可显著改善小鼠的刻板行为、社交缺陷和焦虑样行为，其效果与全身给药相当。

令人意外的是，特异性GABA_A受体拮抗剂氟马西尼并不能阻断瑞马唑仑的行为改善作用，且VTA内GABA能神经元数量和GAD67表达均无显著变化。相反，VPA暴露小鼠VTA内酪氨酸羟化酶阳性(TH⁺)多巴胺神经元密度显著降低，而瑞马唑仑治疗可防止这种神经元丢失。ELISA检测进一步显示，VPA暴露小鼠VTA组织内多巴胺蛋白表达降低，瑞马唑仑可改善这一变化。

在体外实验中，研究者使用MN9D多巴胺神经元细胞进行验证。首先通过CCK8实验确定VPA对MN9D细胞的IC₅₀为26 mM，并确定200 μM为瑞马唑仑治疗VPA诱导的多巴胺神经元损伤的最佳浓度。瑞马唑仑可保护MN9D细胞免受VPA引起的增殖能力下降，进一步证实了其对多巴胺神经元的保护作用。

化学遗传学抑制VTA多巴胺神经元逆转瑞马唑仑的治疗效果

为验证VTA多巴胺神经元在瑞马唑仑改善作用中的关键地位，研究者采用化学遗传学方法，通过双侧VTA注射AAV2/9-DIO-hM4Di-mCherry和AAV2/9-TH-Cre病毒抑制VTA多巴胺神经元。结果显示，CNO诱导的多巴胺神经元靶向沉默完全逆转了瑞马唑仑对VPA暴露小鼠刻板行为和社交障碍的改善作用。

更重要的是，在DAT-Cre小鼠中，化学遗传学抑制VTA多巴胺神经元可诱导出类似自闭症的行为表型，包括刻板行为、社交缺陷和焦虑样行为，而瑞马唑仑治疗可逆转这些行为异常。这些结果充分表明，VTA多巴胺神经元功能下降是自闭症样行为的重要成因，瑞马唑仑通过改善VTA多巴胺神经元功能发挥治疗作用。

瑞马唑仑通过抑制多巴胺神经元铁死亡改善ASD

为深入探索瑞马唑仑保护VTA多巴胺神经元的具体机制，研究者首先进行了细胞凋亡检测。Annexin V流式细胞术结果显示，瑞马唑仑可缓解VPA诱导的多巴胺神经元凋亡，但Western blot检测发现经典凋亡通路蛋白BAX、Bcl-2和Caspase 3均无显著变化，提示可能存在其他细胞死亡途径。

后续实验聚焦于铁死亡这一新型细胞死亡方式。在体水平检测发现，VPA暴露小鼠VTA多巴胺神经元中核心铁死亡标志物GPX4表达显著降低，而瑞马唑仑可显著增强GPX4表达。流式细胞术进一步显示，VPA暴露小鼠VTA多巴胺神经元，特别是TH⁺GPX4⁺亚群显著减少，瑞马唑仑可有效缓解这种神经元丢失。电镜观察发现VPA暴露小鼠VTA多巴胺神经元存在线粒体皱缩和嵴丢失，瑞马唑仑治疗可改善这些超微结构改变。VTA转录组测序分析显示，瑞马唑仑给药后铁死亡通路基因表达发生显著改变。

在细胞实验中，研究者检测了铁死亡的关键特征性改变。瑞马唑仑可逆转VPA引起的线粒体膜电位降低、活性氧(ROS)增加、铁离子积聚和脂质过氧化。同时，瑞马唑仑有效改善了VPA引起的还原型谷胱甘肽降低和氧化还原比值变化。Western blot和免疫荧光结果显示，瑞马唑仑可显著改善铁死亡通路关键蛋白GPX4、SLC7A11、ACSL4和TFR1的表达异常。

铁死亡激动剂逆转瑞马唑仑的治疗效果

为确证瑞马唑仑通过逆转VTA多巴胺神经元铁死亡发挥治疗作用，研究者使用两种铁死亡激动剂Erastin和RSL3进行验证。结果显示，铁死亡激动剂可成功逆转瑞马唑仑对刻板行为、社交缺陷和焦虑样行为的改善作用。在细胞水平，铁死亡激动剂同样逆转了瑞马唑仑对线粒体膜电位、脂质过氧化和铁超载的保护作用，并拮抗了瑞马唑仑对铁死亡通路关键蛋白的调节效应。

此外，研究者比较了铁死亡抑制剂与瑞马唑仑的治疗效果。虽然铁死亡抑制剂可显著缓解VPA诱导的行为异常，但其整体效果略逊于瑞马唑仑，特别是在改善焦虑样行为方面。这表明除了抑制铁死亡外，瑞马唑仑可能还通过其他机制参与ASD的治疗。

讨论与结论

本研究首次报道了瑞马唑仑在ASD治疗中的剂量和持续时间效应，意外发现单次腹腔注射即可产生持续3-7天的治疗效果。研究证实VTA多巴胺神经元是瑞马唑仑治疗ASD的关键靶点，其作用机制主要通过抑制铁死亡实现。

值得注意的是，瑞马唑仑对ASD的长期治疗效果不受氟马西尼拮抗，提示其作用可能不依赖于经典的GABA_A受体信号通路。VPA暴露诱导的铁死亡可能是一个从出生后早期开始并持续进展的过程，瑞马唑仑可能通过暂时阻断进行中的铁死亡，挽救受损但尚未完全死亡的多巴胺神经元，从而恢复其功能并改善行为表型。

该研究为ASD的发病机制提供了新的视角，揭示了铁死亡在VTA多巴胺神经元损伤中的关键作用，并为瑞马唑仑作为潜在ASD治疗药物的开发提供了实验依据。未来研究将进一步探索瑞马唑仑作用于多巴胺神经元的具体分子靶点，以及其在男女ASD模型中的疗效差异。