《Advanced Science》：NPM1 Mediates mRNA Sorting into Extracellular Vesicles via Specific RNA Motif Binding and Phase Separation
NPM1 Mediates mRNA Sorting into Extracellular Vesicles via Specific RNA Motif Binding and Phase Separation
1 Introduction
细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）是由大多数细胞类型分泌的膜性囊泡，已成为细胞间通信的关键介质，在细胞间转移蛋白质、脂质和核酸。通过这些过程，EVs影响广泛的生理和病理事件，包括发育、免疫反应和肿瘤进展。在EV货物中，RNA分子，包括信使RNA（mRNA），因其在受体细胞中调节基因表达的潜力而备受关注。早期研究证明EVs携带功能性mRNA，这些mRNA在转移后能够进行翻译。然而，尽管对EVs中的微RNA（miRNA）已有广泛研究，但控制mRNA分选和转移的精确机制仍然知之甚少。因此，解决这一空白至关重要，因为选择性mRNA包装可能决定EVs在健康和疾病中的功能影响。
RNA结合蛋白（RNA-binding proteins, RBPs）可能驱动mRNA分选进入EVs，但其具体作用和机制尚不清楚。例如，像FUS这样的RBP识别序列基序以细胞类型特异性方式将miRNA分选进入EVs。近期证据还表明，RBPs和RNAs可能通过液-液相分离（Liquid-Liquid Phase Separation, LLPS）聚集成生物分子凝聚体，这可能促进RNA包装进入EVs。然而，参与mRNA分选的关键RBPs——以及它们是否利用LLPS——仍然未知。
本研究旨在揭示mRNA被选择性包装进入EVs的分子机制。
2 Result
2.1 Identification of NPM1 as a poly(A)+RNA Binding Protein in EVs
为了研究EVs运输mRNA的机制，研究首先从HeLa细胞培养上清中分离并鉴定了EV颗粒。通过差速离心法分离EVs，并利用透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope, TEM）和纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis, NTA）进行表征，符合MISEV2023指南。蛋白质印迹分析结果显示，EV标志物如Alix、CD63、CD9在EVs中的含量远高于其亲本细胞，而Calnexin和GAPDH的丰度则在细胞组分中更为显著。
为了鉴定EVs中完整的mRNA结合蛋白组，研究采用了相互作用组捕获方法，检测了从HeLa细胞释放的小EVs中与多聚腺苷酸（poly(A)) RNA连接的RBPs。该方法整合了紫外交联（UV cross-linking）和寡聚dT（oligo(dT)）亲和捕获技术，用于分离与poly(A) RNA相互作用的蛋白质。经过RNase处理和蛋白酶K消化后，通过蛋白质组学分析，共鉴定出213个蛋白质为poly(A) RNA相互作用组。细胞组分聚类分析显示，寡聚dT捕获的EV蛋白中“细胞外外泌体”类别显著富集，表明该方法对EVs/外泌体具有特异性。功能聚类分析揭示了“poly(A) RNA结合蛋白”类别的显著富集。在该类别中，对富集的蛋白质进行排名，筛选出可能的RBPs，包括UBC、EDF1、FKBP3、NPM1、DCD、DSP和ANXA2。
基于蛋白质组学分析，研究选择了在EVs中鉴定出的RBPs进行后续研究。首先，使用相应的短发夹RNA（short hairpin RNA, shRNA）构建体有效敲低了编码UBC、NPM1和DSP的基因，将其表达水平降低至10%–20%。随后，分析了来自上述基因敲低细胞的EVs中的mRNA表达水平。研究选择真核翻译延伸因子1α1（EEF1A1）mRNA作为代表性例子，考察RBP敲低对mRNA水平的影响，因为先前多项研究已发现EEF1A1 mRNA在EVs中大量存在。结果显示，与亲本细胞相比，敲低NPM1导致EVs中EEF1A1 mRNA表达显著降低。这些发现揭示了NPM1蛋白与EEF1A1 mRNA之间的正相关关系，表明NPM1可能作为参与mRNA选择性包装进入EVs的RBP。研究进一步通过poly(A) RNA pull-down实验结合免疫印迹验证了NPM1与通用poly(A) RNA的结合亲和力，证实了NPM1的mRNA结合能力。此外，使用Qubit RNA HS测定法对EV来源的RNA进行定量显示，NPM1敲低后总RNA含量减少，表明NPM1缺失会降低EVs中的RNA含量。
2.2 NPM1 Facilitates the Selective Sorting of Motif-Containing mRNA into EVs
接下来，研究探讨了NPM1对mRNA加载到EVs中的影响。为了更全面地研究NPM1在mRNA加载到EVs中的作用，研究利用CRISPR-Cas9系统成功构建了NPM1基因敲除（Knockout, KO）的HeLa细胞系。来自NPM1-KO细胞的EVs显示NPM1完全缺失，而EV标志蛋白ALIX和CD9与作为对照的野生型（Wild-Type, WT）细胞来源的EVs相比没有显著改变。获得NPM1-KO EVs后，进行了RNA测序（RNA-seq）分析，以研究NPM1运输的特定mRNA类型。分析发现，NPM1-KO EVs和WT EVs中均鉴定出数万种mRNA。火山图分析显示，与WT EVs相比，NPM1-KO EVs中mRNA表达水平显著降低的占多数。基因聚类分析进一步表明，NPM1-KO EVs中多种特定mRNA的水平低于WT EVs。然而，热图显示，与EVs中观察到的显著差异相反，各自亲本细胞中的mRNA水平相似。这很可能反映了NPM1在介导mRNA从细胞转运到EVs中的作用。
鉴于受体细胞的功能可能受EVs携带的mRNA调控，利用生物信息学分析EV mRNA，以理解细胞摄取EVs后的功能。使用DisGeNet数据库分析发现，富集的mRNA可根据其与多种恶性肿瘤的相关性进行分类。KEGG通路分析结果也显示EV mRNA与癌症相关通路富集。考虑到NPM1与包括白血病和非小细胞肺癌（NSCLC）在内的多种恶性肿瘤相关，研究假设NPM1可能促进致癌mRNA向EVs的转运。与已报道的肺癌患者血清中富集的细胞游离mRNA进行比较，发现这些mRNA在NPM1-KO EVs中也减少，提示NPM1可能在肿瘤发展中发挥作用。从中选择了一些代表性的癌症相关mRNA进行进一步的定量聚合酶链反应（qPCR）分析。qPCR分析确定，与对照EVs相比，来自NPM1-KO细胞的EVs中EGFR、IGF2R和TLK2的mRNA水平显著降低。相反，RPL5或TAF15没有显著变化，这与RNA-seq结果一致。值得注意的是，上述mRNA水平在对照和NPM1-KO细胞中相对稳定。这很可能反映了NPM1在介导mRNA从细胞转运到EVs中的作用。
进一步，研究使用RNA免疫沉淀（RNA Immunoprecipitation, RIP）技术研究了mRNA与NPM1的相互作用。在细胞中过表达NPM1后，采用RIP方法分离NPM1。RIP分析显示，在过表达NPM1细胞的pull-down产物中，EGFR、IGF2R和TLK2 mRNA的水平显著增加，而输入样本中没有观察到明显变化。这些发现表明EGFR、IGF2R和TLK2 mRNA与NPM1结合。正如预期，在过表达NPM1细胞的pull-down产物中，RPL5或TAF15 mRNA的水平与对照细胞相比没有显著差异，表明mRNA分子与NPM1的结合是选择性的。为了进一步研究NPM1和mRNA之间的相互作用，进行了荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization, FISH）实验。该技术能够可视化NPM1和mRNA的细胞内定位。具体地，使用合成的单链RNA FISH探针标记EGFR mRNA。观察发现，EGFR荧光信号与NPM1在细胞质中共定位，表明这两个组分在细胞环境中存在潜在的结合相互作用。
接下来，从WT细胞和NPM1-KO HeLa细胞中分离EVs，并将其加入到HEK293T受体细胞中。qPCR和流式细胞术分析表明，与阴性对照（Negative Control, NC）组相比，添加来自HeLa细胞的EVs后，EGFR、IGF2R和TLK2的靶mRNA表达水平出现统计学显著上升。这种由EV诱导的靶mRNA增加在NPM1敲除后显著减弱，并且与NC组相比不再具有统计学显著性。此外，在摄取WT细胞来源EVs的细胞中，EGFR蛋白水平显著升高，但在用NPM1-KO细胞来源EVs处理的细胞中则没有。虽然数据显示EV来源的mRNA可以诱导受体细胞发生统计学显著变化，但需要指出的是，这些递送的转录本的绝对丰度仍然较低，这是EV介导的核酸转移的普遍特征。
2.3 Elevated EGFR mRNA in Serum EVs from NSCLC Patients Correlates with NPM1 Expression
研究接下来旨在探究EV携带的NPM1和mRNA（如EGFR）的生理作用。图2E中的RNA-seq分析表明，癌细胞中EV mRNA的分选与肺大细胞癌相关。先前研究已记录NSCLC患者肿瘤组织中NPM1蛋白水平升高。为了探究EV相关的NPM1是否与肿瘤发展相关，研究首先比较了NSCLC患者和健康供者血清来源EVs中的NPM1蛋白水平。首先，从18名NSCLC患者和18名健康供者的血清样本中分离出EVs。NTA表征显示这些EVs的模态大小或颗粒数量没有显著差异。然而，对EV裂解液的蛋白质印迹分析显示，与健康供者来源的EVs相比，癌症患者来源的EVs中NPM1蛋白的丰度显著增加。癌症患者EVs中的EGFR mRNA水平也高于健康供者EVs。
通过计算EVs中NPM1和EGFR mRNA水平之间的Pearson相关系数，研究证明了NSCLC患者EVs中NPM1蛋白的丰度与癌症相关mRNA的存在呈正相关。这些发现与之前在癌细胞来源EVs中的观察结果一致。研究推测，EVs内的NPM1通过EVs运输EGFR mRNA来调节受体细胞中的EGFR蛋白表达，这一机制可能具有临床意义。
2.4 Determination of EV mRNA Motif Bound to NPM1
研究接下来旨在鉴定与NPM1相互作用并介导mRNA选择性加载到EVs中的特异性RNA序列。此后，将这些RNA序列称为EVmotif。在分析中，使用计算工具STREME比较了在细胞和EVs中鉴定出的基序，以确定哪些基序在EVs中更常见地富集。在另一组分析中，观察到与NPM1-KO EVs相比，对照EVs中基序显著富集。通过检查和比较NPM1-motif和EV-motif分析，研究结果揭示了一个由八个核苷酸组成的核心基序，特别是“CUGGGAUU”。该基序可能在NPM1介导的EV mRNA转运过程中发挥重要作用，从而作为一个功能基序。有趣的是，研究发现该基序存在于EGFR和IGF2R mRNA中，但不存在于RPL5或TAF15 mRNA中，这与图2G–I所示结果一致。
为了确定NPM1与EVmotif之间的结合亲和力，研究合成了一个包含该基序序列的RNA探针，其3’末端连接有生物素。使用涉及纯化NPM1和链霉亲和素修饰的磁珠的共培养系统，研究发现本研究中使用的RNA探针有效地促进了NPM1的pull-down。此外，对六种不同序列的比较证实，CUGGGAUU基序在促进mRNA转运到EVs方面表现出最强的能力。进一步，Alpha-fold预测结果证实了NPM1与鉴定出的RNA基序“CUGGGAUU”之间的相互作用。当根据预测的结构结果突变基序中的重要碱基时，NPM1与RNA的结合亲和力降低。研究结果表明，与随机序列RNA组成的对照相比，NPM1对包含基序序列的RNA表现出更高的结合亲和力。
此外，为了证明EVmotif在辅助mRNA选择方面的潜力，研究利用了一个经过充分验证的细胞报告系统，该系统允许在Cre-LoxP重组过程中可视化EV的细胞间交换。值得注意的是，先前报道通过qPCR和蛋白质印迹分析表明，是Cre mRNA而非Cre蛋白通过EVs转移。在本研究采用的模型中，通过将目标RNA基序附加到Cre mRNA的3’末端进行了改造，以检查该基序在促进Cre mRNA转运到EVs中的潜在作用。在此实验设置中，将鉴定出的核心基序“CUGGGAUU”与质粒中的Cre mRNA序列连接，然后转染到EV供体细胞中。这些细胞产生含有Cre-CUGGGAUU mRNA的EVs，这些EVs被表达两侧为LoxP位点的DsRed和下游eGFP cassette的细胞摄取。通过EVs摄取Cre mRNA后，Cre介导的重组切除DsRed并激活eGFP表达，导致荧光从红色变为绿色的可见转换。这种颜色变化是Cre mRNA成功转移的直接读数。为了确认EVs中Cre mRNA的存在和完整性，使用了表达CFP的供体细胞，并在分离的EVs中检测到Cre mRNA。这些发现表明受体细胞有能力表达并有效利用Cre蛋白。将CFP供体细胞与dsRed受体细胞共培养后，可检测到eGFP信号。此外，当CUGGGAUU基序与供体细胞中的Cre mRNA连接时，观察到受体细胞中eGFP荧光强度增加。流式细胞术分析结果进一步证实，表达鉴定出的基序Cre-CUGGGAUU的细胞通过EV介导的Cre-LoxP重组表现出eGFP阳性细胞数量增加。这一发现表明，鉴定出的基序的存在增强了被转运mRNA的选择。为了验证NPM1在此过程中的功能，使用NPM1-KO细胞作为供体细胞进行了类似实验。结果显示eGFP阳性细胞比率显著下降，并且观察到EV-motif没有能力提高此比率。重复实验中对GFP阳性细胞比率的量化表明，该基序可以以NPM1依赖的方式促进mRNA向EVs的转运。此外，为了直接测量EVs中mRNA的含量，进行了qPCR分析，发现连接CUGGGAUU基序后，WT细胞组中EVs内的Cre mRNA量显著增加。然而，在NPM1-KO供体细胞组中，EVs中Cre-mRNA的相对含量在Cre-motif组和Cre-野生型（Cre-WT）组之间没有表现出统计学显著增加。这表明，在NPM1缺失条件下，连接基序对mRNA转运的增强作用被有效抑制。
鉴于发现的EV-motif，研究尝试调节EVs中mRNA的分选。构建了一个细胞系，通过在其3’非翻译区（Untranslated Regions, UTR）内引入EV-motif修饰来增强EGFR mRNA的表达。与WT组相比，修饰EGFR mRNA的组在EVs中的含量增加了三倍。将这些EVs添加到受体细胞中，导致受体细胞中EGFR的mRNA和蛋白水平均显著增加。这项研究展示了一种通过EVs介导的细胞间mRNA转运来控制受体细胞的新方法，这在未来的RNA递送应用中具有潜力。
2.5 NPM1 Colocalizes with mRNAs in Late Endosomes and Multivesicular Bodies (MVBs)
在确定了NPM1结合mRNA内的特异性基序以促进其分选进入EVs后，研究接下来旨在阐明细胞内NPM1-RNA相互作用的空间动力学。首先，进行了蔗糖梯度离心实验以分离不同的细胞器。研究发现，细胞质NPM1出现在低密度组分中，并与晚期内体（late endosomes）和多泡体（Multivesicular Bodies, MVBs）共定位，而不是与内质网（Endoplasmic Reticulum, ER）共定位。这些细胞器是已知的参与EV生物发生的先驱。
接下来，研究调查NPM1和RNA是否在晚期内体和MVBs中共定位。在NPM1-KO细胞中构建了过表达CD63-GFP和NPM1-mCherry荧光蛋白的细胞系。然后，引入了一个17 bp的单链EGFR mRNA探针，该探针包含CUGGGAUU基序，并用CY5标记。首先从转染了CD63-GFP、NPM1-mcherry和RNA-CY5的细胞系中收集EVs。通过结构光照明显微镜（Structured Illumination Microscopy, SIM）观察到CD63、NPM1与RNA在同一颗粒中的共定位，表明NPM1和RNA都被递送到CD63标记的EVs中。研究还通过免疫荧光显微镜观察了NPM1、RNA与不同细胞内细胞器的关系，发现NPM1和RNA颗粒随后被CD63包装成囊泡结构，表明NPM1和RNA被招募到MVBs中。相比之下，早期内体标志物EEA1与NPM1和RNA的共定位有限，表明NPM1和RNA的包装过程仅发生在晚期内体阶段。对NPM1和RNA与各种细胞器（包括ER、高尔基体、早期内体、晚期内体、MVBs和溶酶体）共定位的定量分析证实，NPM1和RNA的共定位主要发生在晚期内体和MVBs中。为了进一步验证NPM1在此包装过程中的关键作用，分别裂解WT和NPM1-KO细胞系，然后通过差速离心进行分级分离。在不同组分中检测RNA探针荧光信号显示，NPM1缺失损害了RNA向MVBs的运输。
2.6 NPM1 Forms Phase Separation Droplet with RNAs before Entering into MVBs
接下来，研究着手调查NPM1将mRNA带入MVBs的潜在机制。鉴于NPM1是一种众所周知的易于发生相分离的蛋白质，并且可以诱导其核酸结合和核泄漏，研究假设NPM1与mRNA形成相分离液滴，从而启动包装进入MVBs的过程。当使用寡聚d(T)探针进行FISH实验以标记细胞中的总mRNA时，观察到当NPM1被敲除时，细胞质中由mRNA形成的颗粒结构减少。这表明NPM1可能促进mRNA凝聚体的形成。
作为蛋白质相分离凝聚体形成的先决条件，研究使用预测天然无序区域的PONDR计算工具预测了NPM1序列内的固有无序区域（Intrinsically Disordered Regions, IDRs），鉴定出一个显著的跨越氨基酸120-224的IDR。研究还通过二琥珀酰亚胺辛二酸酯（Disuccinimidyl Suberate, DSS）交联实验验证了NPM1具有自我寡聚化的能力。接下来，在大肠杆菌BL21中表达并纯化了带有GFP标记的人NPM1蛋白。通过将NPM1与CY3标记的RNA探针结合，观察到了具有动态流动性的相分离液滴。荧光漂白恢复（Fluorescence Recovery After Photobleaching, FRAP）显示，该共凝聚体中的NPM1和RNA都是动态的。通过调整NPM1和RNA的浓度，发现NPM1的浓度是相分离形成的驱动力，这是由于其固有的相分离能力。然而，随着RNA浓度的增加，相分离 puncta 的数量也相应增加。这表明RNA不仅参与与NPM1形成相分离，而且积极促进其形成。由于NPM1的C端70个氨基酸负责RNA结合，研究试图通过使用NPM1截短体来强调NPM1的RNA结合能力对于凝聚体形成的重要性。当使用纯化的N端截短NPM1时，它失去了自我相互作用诱导的相分离能力，但其RNA结合亲和力仍然保留。添加RNA导致了液滴的形成，表明结合区域在NPM1和RNA的相分离过程中的重要性。
研究假设，在NPM1-RNA凝聚体液滴形成并被MVBs包装后，膜囊泡也可能被招募到该凝聚体中，促进NPM1-RNA复合物进入EVs。研究进一步将NPM1相分离液滴与用Dil红色荧光染料标记的收集到的EVs混合。发现这些膜成分可以很容易地整合到液滴中，证明了NPM1液滴与膜的相容性。
此外，研究结果表明，存在一个CD63向已形成的NPM1和RNA凝聚体液滴的招募过程。NPM1首先与RNA形成凝聚体，随后招募CD63在同一液滴中建立共定位。用于捕捉MVBs、NPM1和RNA动态运动的活细胞共聚焦成像显示，NPM1-RNA凝聚体最终被包装在CD63标记的MVBs中。总之，这些发现揭示，NPM1可以与RNA形成相分离液滴，尤其是在RNA丰富的情况下。这些液滴被MVBs包装，随后被递送到EVs中。
3 Conclusion
尽管在过去15年中，在理解EVs及其RNA货物方面取得了重大进展，但其潜在分选机制的许多方面仍然难以捉摸。先前研究表明，在EVs内的长RNA转录本中，大多数是mRNA，这强调需要破译mRNA是如何被选择性纳入的。本研究
