《Advanced Science》：Resolvin D5 Inhibits CXCL8 Expression in Colonic Epithelial Cells Through Activating GPR101 to Impede Neutrophil Recruitment and Consequently Alleviate Ulcerative Colitis
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本研究揭示了Resolvin D5（RvD5）通过激活GPR101受体抑制STAT1/CXCL8信号轴，显著降低结肠上皮细胞趋化因子表达，从而阻遏中性粒细胞向黏膜上皮层浸润并有效缓解DSS诱导的小鼠结肠炎。创新性发现中药活性成分淫羊藿苷A1（Epimedin A1）作为5-脂氧合酶（5-LOX）变构抑制剂可促进M2巨噬细胞内源性RvD5生物合成，为溃疡性结肠炎（UC）治疗提供了新型靶向策略。
1 引言
溃疡性结肠炎（UC）作为慢性炎症性肠病，其发病机制涉及多种免疫细胞异常活化。中性粒细胞在肠道黏膜上皮层的过度浸润是导致上皮屏障破坏和炎症加剧的关键因素。特异性促炎症消退介质（SPMs）在维持肠道稳态中发挥核心作用，其中来源于二十二碳六烯酸（DHA）的Resolvin D5（RvD5）在UC患者炎症黏膜组织中显著低表达，且与疾病严重程度负相关。然而，外源性RvD5能否调控中性粒细胞浸润进而改善结肠炎尚待阐明。
2 研究方法
采用2.5%葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导C57BL/6小鼠结肠炎模型，通过腹腔注射RvD5（2/5 μg/kg）或口服5-氨基水杨酸（5-ASA）进行干预。采用流式细胞术检测结肠黏膜上皮层和固有层中性粒细胞（Ly6G+CD11b+）比例，免疫荧光染色观察组织浸润情况。通过体外Transwell实验验证RvD5对中性粒细胞向结肠上皮细胞（NCM460/HT-29）的趋化作用。利用siRNA技术敲低GPR101/GPR32表达，结合cAMP检测和蛋白免疫印迹分析下游信号通路。通过生物信息学筛选CXCL8相关转录因子，采用q-PCR和Western blot验证STAT1表达调控机制。基于分子对接技术从天然产物库筛选5-LOX变构抑制剂，通过UPLC-MS/MS检测M2巨噬细胞内RvD5合成水平。
3 研究结果
3.1 RvD5改善结肠炎并特异性抑制上皮层中性粒细胞浸润
RvD5干预显著缓解DSS小鼠体重下降、疾病活动指数（DAI）升高和结肠缩短等病理表现（图1A-E）。组织学检测显示RvD5有效改善黏膜充血水肿和隐窝结构破坏（图1F-G）。关键发现在于RvD5选择性降低结肠黏膜上皮层而非固有层的中性粒细胞比例（图1I-L），髓过氧化物酶（MPO）活性检测和Ly6G免疫荧光染色进一步验证该特异性抑制作用（图1H,M）。
3.2 中性粒细胞回输实验验证靶点必要性
过继转移中性粒细胞显著逆转RvD5对MPO活性的抑制效应（图2A），并削弱其减少上皮层中性粒细胞浸润的能力（图2B-D）。同时，回输组小鼠DAI评分和结肠病理损伤加重（图2E-K），证实抑制中性粒细胞浸润是RvD5发挥抗炎作用的核心机制。
3.3 RvD5通过下调CXCL8抑制中性粒细胞趋化
在TNF-α刺激的结肠上皮细胞中，RvD5选择性抑制CXCL8（小鼠同源物CXCL1）的mRNA和蛋白表达（图3E-H），而对CXCL7/CXCL10/CCL20无显著影响。Transwell实验显示条件培养基中RvD5剂量依赖性抑制中性粒细胞迁移（图3A-D），CXCL8过表达质粒转染可逆转该抑制作用（图3I-K），明确CXCL8是介导RvD5调控趋化效应的关键因子。
3.4 GPR101介导RvD5信号转导
GPR101敲低显著减弱RvD5对CXCL8表达的抑制作用（图4A-E）和中性粒细胞趋化抑制能力（图4F-G），而GPR32敲低无此效应。机制上，RvD5通过激活GPR101升高细胞内cAMP水平并促进PKA磷酸化（图4H-M），表明GPR101-cAMP-PKA信号轴参与调控过程。
3.5 STAT1转录因子下游调控机制
生物信息学分析发现UC患者黏膜组织中GPR101与STAT1表达负相关（图5A-C）。体外实验证实RvD5通过GPR101依赖方式抑制STAT1 mRNA和蛋白表达（图5D-K），STAT1过表达质粒转染可拮抗RvD5对CXCL8的调控作用（图5L-N）。JAK抑制剂Ruxolitinib预处理后RvD5不再进一步抑制CXCL8，提示STAT1是GPR101下游关键转录因子。
3.6 体内验证GPR101功能重要性
AAV-shGPR101病毒干扰小鼠结肠GPR101表达后，RvD5对STAT1/CXCL8的抑制作用被显著削弱（图6A-C），同时其中性粒细胞浸润抑制和结肠炎缓解效应也相应减弱（图6D-K），证实GPR101是RvD5发挥体内疗效的必要受体。
3.7 淫羊藿苷A1促进内源性RvD5合成
分子对接筛选发现淫羊藿苷A1可与5-LOX变构位点结合（图7D-G），细胞热转变分析（CETSA）验证其直接结合作用（图7H-I）。在IL-4/IL-13诱导的M2巨噬细胞中，淫羊藿苷A1处理显著提升RvD5合成水平（图7C），且该效应可被5-LOX抑制剂Zileuton阻断（图7J）。
3.8 淫羊藿苷A1模拟RvD5抗炎效应
动物实验显示淫羊藿苷A1（10/20 mg/kg）灌胃给药可剂量依赖性提高结肠组织RvD5含量（图8A），降低上皮细胞CXCL1表达（图8B-C）和MPO活性（图8D），显著抑制中性粒细胞上皮层浸润（图8E-G）。同时有效改善DAI评分、结肠缩短和组织病理损伤（图8H-N），其疗效优于传统药物5-ASA。
4 讨论
本研究系统阐释了RvD5-GPR101-STAT1-CXCL8信号轴在调控中性粒细胞黏膜浸润中的核心作用，突破性发现中药成分淫羊藿苷A1通过变构抑制5-LOX促进内源性RvD5生物合成的新机制。相较于外源性RvD5补充，淫羊藿苷A1介导的内源性调控策略更具临床转化潜力，为UC治疗提供了兼顾疗效与安全性的新型候选药物。
5 结论
RvD5通过激活结肠上皮细胞GPR101受体，抑制STAT1介导的CXCL8表达，从而阻遏中性粒细胞向黏膜上皮层浸润，最终缓解溃疡性结肠炎病理进程。淫羊藿苷A1作为5-LOX变构抑制剂，可有效促进M2巨噬细胞内RvD5生物合成，展现良好的 therapeutic potential。
