靶向胶原蛋白的溶瘤益生菌LR@MP通过钙离子-活性氧轴引发线粒体代谢灾难治疗实体瘤

《Advanced Science》：Oncolytic Probiotics with Molecular Pili for Solid Tumor Therapy

本综述创新性地提出利用分子菌毛（MP）修饰的益生菌（LR@MP）治疗实体瘤的双重优化策略。研究揭示LR通过诱导钙离子（Ca2+）超载触发线粒体活性氧（mtROS）爆发导致肿瘤细胞死亡，而MP修饰可特异性锚定肿瘤胶原基质，使瘤内细菌富集量提升2倍。在4×105CFU安全剂量下，LR@MP显著抑制黑色素瘤和结直肠癌模型60%-80%的肿瘤生长，并通过联合PD-L1阻断克服耐药性，为活菌疗法临床转化提供新范式。

　　

1 引言

细胞免疫疗法和溶瘤病毒（OVs）虽为癌症治疗带来新机遇，但在实体瘤应用中面临肿瘤微环境（TME）抑制、抗原异质性及系统给药安全性等挑战。细菌疗法因其固有肿瘤靶向性和多机制溶瘤作用成为替代方案，但减毒病原体（如鼠伤寒沙门菌）存在天然毒力风险。相比之下，益生菌（如乳酸杆菌）具有更优安全性（GRAS认证），并被工程化为“活体工厂”以重塑免疫抑制性TME。本研究提出通过分子菌毛（MP）修饰增强益生菌在肿瘤胶原基质中的锚定能力，从而引发代谢灾难性细胞死亡。

2 结果

2.1 溶瘤益生菌LR通过线粒体ROS爆发诱导肿瘤细胞死亡

通过共培养实验筛选发现，鼠李糖乳杆菌（LR）对B16-F10黑色素瘤细胞具有显著细胞毒性（细胞:细菌=1:10时死亡率>50%），且活性依赖细菌存活状态。机制研究表明，LR cytotoxicity与线粒体活性氧（mtROS）爆发密切相关，沉默氧化还原酶p66Shc可抑制mtROS生成并提高细胞存活率。

2.2 LR通过钙离子超载触发ROS爆发

蛋白质组学分析显示LR处理后肿瘤细胞线粒体蛋白组广泛下调，电子传递链（ETC）复合物I/III亚基选择性沉默。钙离子荧光探针检测证实LR引起胞质钙浓度持续升高，使用钙螯合剂EGTA/BAPTA-AM可完全逆转LR的细胞毒性。进一步实验表明，钙超载通过诱导线粒体分裂（Drp1激活）导致膜电位崩溃，最终引发mtROS爆发。

2.3 LR@MP的构建与肿瘤靶向特性

采用Sulfo-SMCC交联剂将胶原靶向肽（RLRELHLNNNC）共价修饰于LR表面，形成分子菌毛（MP）结构。LR@MP在冻干后仍保持高存活率，且对I型胶原的结合亲和力提升200倍以上。转录组学分析显示MP修饰上调应激响应基因（如cspA），增强巨噬细胞M1极化（53.1% vs 37.7%）和树突细胞成熟，促进外周组织细菌清除。

2.4 LR@MP通过线粒体功能障碍抑制实体瘤进展

在结直肠癌和黑色素瘤模型中，LR@MP（4×10⁵CFU）显著抑制肿瘤生长（60%-80%），瘤内富集量提升2倍且肝部细菌负荷降低。72小时转录组分析显示能量代谢和线粒体功能相关基因集下调，钙信号通路显著富集，同时免疫抑制信号（特别是T细胞负调控）上调。

2.5 代谢重编程介导的肿瘤细胞逃逸机制

LR筛选存活细胞呈现衰老表型，伴随PD-L1和MHC-I表达上调。机制上，mtROS激活HIF-1α/NF-κB通路驱动PD-L1转录，同时代偿性上调G6PD活性以清除ROS。共培养实验证实PD-L1阻断可恢复OT-1 T细胞对LR处理后的B16-OVA细胞的杀伤效力。

2.6 联合PD-L1阻断实现长期疗效

LR@MP联合抗PD-L1抗体在动物模型中展示最佳抑瘤效果，显著延长小鼠中位生存期。早期治疗阶段联合组促进CD4⁺/CD8⁺T细胞浸润，后期通过抑制Treg比例维持杀伤活性。免疫组化显示联合治疗降低胶原沉积并逆转PD-L1上调。

3 讨论

3.1 从递送载体到内在杀伤剂的转变

与传统工程化益生菌（如EcN）依赖外源基因表达不同，LR本身具备强代谢毒性，在低剂量（10⁵CFU）即可通过“钙-ROS-生物能量”轴诱发肿瘤细胞死亡。

3.2 代谢程序化细胞死亡机制

LR代谢产物（乳酸/短链脂肪酸）通过激活酸敏感离子通道（ASICs）和GPR43受体诱发钙内流，进而诱导线粒体分裂和ETC崩溃，最终导致mtROS爆发。

3.3 理性工程化策略

化学修饰MP实现快速肿瘤锚定，后续细菌增殖虽稀释表面MP但已建立瘤内定植。未来可通过基因工程稳定表达胶原结合域，并优化代谢通路增强溶瘤效应。

3.4 耐药机制与联合免疫治疗

代谢压力驱动肿瘤细胞通过PD-L1上调实现免疫逃逸，联合检查点阻断可协同激活T细胞免疫，逆转免疫抑制微环境。

3.5 安全性特征

LR@MP在安全剂量下仅引起短暂炎症反应，其革兰氏阳性特性避免内毒素风险，治疗指数优于基因工程菌株。

3.6 局限性与展望

需在患者来源异种移植（PDX）模型中验证代谢杀伤区假说，并探索该疗法诱导的系统性免疫记忆效应。

4 结论

本研究证实非转基因LR@MP可通过代谢毒性机制有效抑制实体瘤，但需联合PD-L1阻断克服适应性耐药。该策略为下一代活菌疗法提供新思路。