《Advanced Science》：TGFβ1 Activates Lnc-APUE to Promote Tumor Metastasis via the Alu Element-Driven STAU1-Mediated Decay of CDH1 mRNA
编辑推荐：
本综述系统揭示了TGFβ1/SMAD/lnc-APUE/E-cadherin信号轴在肝癌转移中的新机制。研究发现TGFβ1通过SMAD2结合lnc-APUE启动子激活其转录，上调的lnc-APUE通过Alu元件与CDH1 mRNA的3'UTR区域形成RNA双链结构，招募STAU1和UPF1引发STAU1介导的mRNA降解（SMD），导致E-cadherin表达下调，最终促进肝癌细胞迁移和侵袭。该研究为肝癌治疗提供了新的潜在靶点。
1 引言
Alu元件作为灵长类特异的短散在重复序列，占人类基因组的10%以上。这些约280nt的逆转录转座子通常由自由的左Alu单体（FLAM）和右Alu单体（FRAM）通过富含A的连接子连接而成。Alu元件优先位于基因丰富的基因组区域，特别是在mRNA的内含子和3'非翻译区（3'UTR）以及长链非编码RNA（lncRNA）中。大约25%的lncRNA携带Alu元件，但其调控功能尚未完全阐明。
lncRNA是一类长度超过500nt且无蛋白质编码潜能的RNA大家族。研究表明lncRNA通过RNA-DNA、RNA-RNA和RNA-蛋白质相互作用参与多种生物学过程和疾病发生。近年研究发现lncRNA中的Alu元件具有重要调控功能，例如lncRNA LEADeR中的Alu元件可与干扰素调节因子1（IRF1）靶基因启动子中的Alu元件相互作用，阻止IRF1与靶基因启动子结合；MALAT1中的Alu元件与HNRNPK结合驱动其核转位；而1/2-sbsRNA1中的Alu元件可通过与mRNA 3'UTR中的Alu元件杂交形成STAU1结合位点（SBS），招募STAU1和UPF1促进mRNA降解。
肝细胞癌（HCC）是一种常见的肝脏恶性肿瘤，由于高转移率和复发率导致预后不良。转化生长因子-β1（TGFβ1）作为肿瘤微环境中丰富的细胞因子，其信号增强可促进HCC的转移和免疫抑制。前期研究发现lnc-APUE（加速E2F1上调促进增殖的lncRNA）在HCC中上调，并通过作为miR-20b海绵上调E2F1表达来促进G1/S期转换和肝癌细胞生长。然而，lnc-APUE失调是否参与肿瘤转移尚未见报道。
2 结果
2.1 Lnc-APUE通过Alu元件与CDH1 3'UTR碱基配对降低CDH1 mRNA水平
研究发现lnc-APUE序列中含有单个Alu元件。通过IntaRNA和BLASTN预测，发现1818个候选mRNA的Alu元件可与lnc-APUE的Alu序列形成互补碱基配对。经过严格筛选，最终确定CDH1、DHODH、TBXA2R、APOL6和IGF1五个候选基因，其中CDH1 3'UTR内的Alu元件与lnc-APUE的Alu元件具有最高的碱基配对潜力，ΔG值为-105.24 kcal/mol。
实验证实lnc-APUE沉默可上调多个肝癌细胞系中CDH1 mRNA水平，而过表达lnc-APUE则降低CDH1 mRNA水平。相应地，E-cadherin蛋白水平在lnc-APUE沉默后增加，过表达后减少。临床样本分析显示，与癌旁组织相比，HCC组织中lnc-APUE上调而CDH1下调。
RNA-RNA电泳迁移率变动分析（EMSA）显示，CDH1-Alu片段与野生型APUE-Alu片段孵育后出现迁移带偏移，表明形成稳定的Alu:Alu异源双链。当APUE-Alu片段发生突变（APUE-Alu mut）破坏其与CDH1-Alu的碱基配对时，迁移带偏移消失。双荧光素酶报告基因分析进一步验证lnc-APUE通过结合CDH1 3'UTR下调CDH1表达。S1m标签RNA亲和力实验证实lnc-APUE通过Alu元件直接结合CDH1 3'UTR，而删除或突变lnc-APUE的Alu元件会消除其降低CDH1 mRNA水平的作用。
2.2 Lnc-APUE通过Alu依赖性SMD途径促进CDH1 mRNA降解
RNA免疫共沉淀（RIP）实验显示，与IgG对照相比，抗Flag免疫沉淀物中lnc-APUE和CDH1 3'UTR显著富集，而GAPDH未富集。沉默lnc-APUE削弱了STAU1与CDH1 3'UTR的结合，表明lnc-APUE是招募SMD机制至CDH1转录本所必需的。
关键SMD组分STAU1或UPF1的敲除增加了CDH1 mRNA水平并延长了其半衰期，这与lnc-APUE缺失的效果相似。重要的是，沉默STAU1或UPF1消除了lnc-APUE降低CDH1 mRNA丰度和稳定性的作用。荧光素酶报告实验进一步证实，沉默lnc-APUE或STAU1可增强携带野生型CDH1 3'UTR的报告基因活性，但不影响Alu缺失的CDH1 3'UTR报告基因。
2.3 Lnc-APUE通过其Alu元件和STAU1下调CDH1促进肿瘤转移
体外Transwell实验显示，沉默lnc-APUE显著抑制肝癌细胞的迁移和侵袭，而过表达lnc-APUE则增强这些恶性表型。CDH1沉默消除了lnc-APUE敲低对肿瘤细胞迁移和侵袭的抑制作用。值得注意的是，Alu缺失和Alu突变的lnc-APUE均无法增强肿瘤细胞迁移。同样，STAU1敲低消除了lnc-APUE过表达的促迁移作用。
小鼠原位肝移植模型证实，与对照组相比，lnc-APUE沉默的肝癌细胞移植瘤显示原发性肿瘤体积减小，肺和肝转移率降低，转移结节数量减少。而过表达lnc-APUE的移植瘤显示更大的肿瘤体积和更多的转移结节，但其Alu元件的缺失减弱了这些促进作用。免疫组化分析显示，lnc-APUE沉默的移植瘤中E-cadherin水平升高，而过表达lnc-APUE的移植瘤中E-cadherin降低，而lnc-APUE-ΔAlu过表达的肿瘤未见E-cadherin下降。
2.4 Lnc-APUE转录受TGFβ1/SMAD信号诱导
在lnc-APUE转录起始位点上游1.5kb区域内预测到13个SMAD结合元件（SBE）。荧光素酶报告实验显示，TGFβ1处理增强了包含-1553/+70区域报告基因的活性。启动子缺失分析确定-505至-212bp区域包含TGFβ1应答元件，该区域内SBE1/2的缺失或突变可消除P(-505/+70)对TGFβ1的响应。
染色质免疫共沉淀（ChIP）实验显示，与IgG对照相比，抗SMAD2抗体特异性富集已知TGFβ1靶基因CDH2启动子和lnc-APUE启动子-528至-424bp区域的染色质片段。TGFβ1处理显著增加磷酸化SMAD2蛋白水平，并上调lnc-APUE和CDH2表达。TGFBR1抑制剂、TGFBR1敲低或SMAD2/3/4联合敲除均可阻断TGFβ1上调lnc-APUE的作用。此外，沉默lnc-APUE破坏了TGFβ1抑制E-cadherin表达和促进肿瘤细胞迁移/侵袭的作用。
3 讨论
本研究首次揭示了lnc-APUE通过Alu元件促进CDH1 mRNA降解进而驱动HCC转移的分子机制。TGFβ1通过SMAD2直接结合lnc-APUE启动子激活其转录，上调的lnc-APUE通过Alu元件与CDH1 mRNA的3'UTR形成RNA双链，招募STAU1和UPF1激活SMD途径，导致E-cadherin下调并最终促进肿瘤转移。
值得注意的是，lnc-APUE可能通过催化性回收机制而非静态一对一结合来调控靶分子，这解释了低拷贝数lncRNA如何发挥功能。除了新发现的SMD机制外，lnc-APUE还可通过miR-20b/E2F1轴促进肿瘤转移，表明其可能通过多重机制协同调控HCC进展。
E-cadherin下调是肿瘤转移的关键事件，以往机制包括基因组缺失、启动子超甲基化、转录抑制因子过表达等。本研究首次发现Alu元件介导的mRNA降解是E-cadherin下调的新机制。TGFβ1信号除通过上调ZEB1、Snail和Slug等转录抑制因子抑制CDH1转录外，还可通过lnc-APUE介导的转录后调控下调CDH1，丰富了TGFβ1调控CDH1表达的机制网络。
4 实验方法
本研究使用的人类HCC组织来自中山大学肿瘤防治中心接受根治性切除术的患者。细胞实验采用HEK293T、HCCLM9、Huh-7、SK-Hep-1和SNU-449等细胞系。通过慢病毒感染建立稳定表达各种lnc-APUE变体的细胞系。实验方法包括qPCR、蛋白质印迹、免疫组化、荧光素酶报告基因、EMSA、S1m标签RNA亲和纯化、RIP、Transwell和小鼠原位移植模型等。
生物信息学分析利用GEO数据集和RepeatMasker、IntaRNA、NCBI blastn等软件。统计分析使用GraphPad Prism 8.0，数据以均值±标准误表示，采用Student's t检验、单因素或双因素方差分析进行差异显著性检验。
