《CNS Neuroscience & Therapeutics》：β-Asarone Attenuates Neuroinflammation of Alzheimer's Disease by Activating Autophagy and Suppressing NLRP3 Inflammasome Assembly
β-Asarone Attenuates Neuroinflammation of Alzheimer's Disease by Activating Autophagy and Suppressing NLRP3 Inflammasome Assembly
1 Introduction
阿尔茨海默病（Alzheimer's Disease, AD）是一种普遍且进行性的神经退行性疾病。其病理特征典型地表现为细胞外淀粉样蛋白-β（Amyloid-beta, Aβ）斑块的积累、由过度磷酸化Tau蛋白形成的细胞内神经原纤维缠结，以及慢性神经炎症状态。目前的治疗涉及胆碱酯酶抑制剂、NMDA受体拮抗剂及其组合，但这些药物难以从根本上治疗AD。因此，深入研究AD的发病机制和治疗方法至关重要。目前AD发病机制的研究主要集中于Aβ沉积、Tau蛋白过度磷酸化、神经炎症激活和自噬功能障碍等假说。其中，神经炎症和自噬越来越受到研究人员的关注。小胶质细胞中NLRP3介导的炎症反应在神经炎症的发展中至关重要。自噬通过抑制NLRP3炎症小体的形成来减轻过度的炎症反应，从而导致Aβ积累和tau蛋白过度磷酸化的减少。因此，通过激活小胶质细胞自噬来靶向抑制NLRP3炎症小体形成可能是AD管理的一个重要策略。
β-细辛醚（β-asarone）是石菖蒲（Acorus tatarinowii Schott）的一种关键活性成分，该植物在传统中药（Traditional Chinese Medicine, TCM）中用于治疗神经系统疾病有着悠久的历史。许多研究表明，中药能有效缓解早期AD患者的临床症状。因此，从中药中探索高效低毒的化合物用于治疗AD是一种非常有前景的方法。石菖蒲是防治AD的代表性中药，广泛用于临床治疗老年痴呆、癫痫等疾病。之前的实验证实，石菖蒲挥发油是治疗AD的主要药效部位，其中β-细辛醚是石菖蒲挥发油的主要化学成分。研究表明，β-细辛醚通过增强神经保护、促进BDNF合成和释放、抑制Aβ聚集、减少Aβ斑块形成以及促进神经元再生等多种途径影响AD相关靶点。然而，其是否能通过激活自噬抑制NLRP3炎症小体形成来减轻神经炎症，尚未见报道。
本研究的结果证明，β-细辛醚能有效减轻AD小鼠模型中的神经炎症。此外，研究发现β-细辛醚通过激活小胶质细胞自噬来抑制NLRP3炎症小体形成，从而减轻神经炎症。
2 Materials and Methods
2.1 Drug and Reagents
β-细辛醚购自上海源叶生物科技有限公司。多奈哌齐（Donepezil）购自卫材药业（苏州）有限公司。脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）购自上海源叶生物科技有限公司。
2.2 Animal Grouping and Treatment
实验共使用了30只12月龄雄性3×Tg-AD小鼠。在分组前，所有转基因小鼠的认知障碍均通过莫里斯水迷宫（Morris Water Maze, MWM）评估进行验证。然后将小鼠随机分为三个实验组（每组n=10）：3×Tg-AD组、多奈哌齐组（2 mg/kg）和β-细辛醚组（30 mg/kg）。另外十只野生型B6小鼠作为正常对照（WT）组。WT和3×Tg-AD对照组给予生理盐水，药物治疗每天进行一次，持续8周。
2.3 Cell Culture and Treatment
本研究使用了BV-2小胶质细胞。为了建立Aβ诱导的神经毒性体外模型，用25 μM的Aβ25–35肽处理BV-2细胞24小时。将细胞暴露于一系列β-细辛醚浓度（5, 10, 20, 40, 80, 160, 320 μg/mL）以确定最有效浓度。之后，细胞分为以下几类：对照组（仅用DMEM培养的细胞）、Aβ组（用Aβ25–35培养的细胞）、β-细辛醚组（在Aβ25-35干预后给予不同剂量的β-细辛醚12小时）、3-MA（3-甲基腺嘌呤）组（在Aβ25–35干预后同时给予β-细辛醚和10 μM 3-MA处理12小时）。
2.4 Behavioral Test
2.4.1 Morris Water Maze Test (MWM)
在实验程序开始前，让小鼠适应莫里斯水迷宫1天。在随后的5天中，评估它们朝向隐藏平台的导航能力。在此阶段，将小鼠放入水中寻找隐藏平台，每只小鼠在每个象限进行60秒的训练。训练阶段后，移除平台，将每只小鼠从最初平台位置对面的象限放入迷宫。在60秒的探查试验中记录的参数包括游泳轨迹、到达原平台位置的潜伏期、穿越平台位置的次数，以及在目标象限的总距离和时间。
2.4.2 Step-Down Test
让小鼠在平台记录仪上适应5分钟。间隔4小时后，将小鼠重新暴露于平台，进行条件性训练试验，期间通过激活的电刺激器给予足部电击。小鼠跳下平台时会受到肢体电击，促使它们返回平台以避免进一步电击。训练后24小时将小鼠重新引入平台，观察5分钟。记录的参数包括首次跳下的潜伏期和跳跃（错误）次数。
2.5 Cell Counting Kit-8 (CCK-8) Assay
收集对数生长期的细胞，以每孔1.0×105个细胞的密度接种于96孔板中，每孔100 μL。当细胞融合度达到50%–70%时，在无血清培养基中饥饿2小时，然后用不同浓度的药物处理。实验操作按照CCK8说明书中的制造商说明进行。
2.6 Flow Cytometry
收集细胞（0.5~1×106），用PBS洗涤两次，加入100 μL Binding Buffer和FITC标记的Annexin-V（20 μg/mL）10 μL，室温避光孵育30分钟，然后加入PI（50 μg/mL）5 μL。避光反应5分钟后，加入400 μL Binding Buffer，立即通过FACScan进行流式细胞术定量检测。同时，设一管不加AnnexinV-FITC和PI的样品作为阴性对照。
2.7 Histological Analysis of Brain Sections
脑组织在4%多聚甲醛中固定48小时，随后经过梯度乙醇和二甲苯系列处理，然后石蜡包埋。使用切片机制备约4 μm厚的切片，然后脱蜡。对石蜡包埋切片进行苏木精-伊红（Hematoxylin and eosin, HE）染色和尼氏（Nissl）染色，用于光学显微镜下的组织学评估。通过计算HE染色图像中的变性细胞指数（Denatured Cell Index, DCI）来评估神经损伤程度，定义为（变性细胞数/总细胞数）×100。此外，在标准视野内定量含有尼氏体的存活神经元的密度。
2.8 Immunofluorescence
石蜡切片使用不同浓度的乙醇和二甲苯进行脱蜡，然后在预热的EDTA溶液中进行抗原修复。对于细胞免疫荧光，将玻片放入24孔板中并接种细胞。不同组别采用不同方法处理。每孔用4%多聚甲醛溶液固定，并用Triton X-100透化。使用3% BSA封闭石蜡切片和细胞。然后，向封闭的石蜡切片和细胞玻片中加入特异性一抗。一抗包括NeuN（神经元核抗原）（1:200, Abcam, UK）、Aβ（1:200, CST, USA）和Iba-1（离子钙结合适配器分子1）抗体（1:200, CST, USA）。随后，石蜡切片和细胞玻片与相应的二抗一起孵育。图像通过蔡司直立荧光显微镜捕获。
2.9 Immunohistochemistry
石蜡切片使用不同浓度的乙醇和二甲苯进行脱蜡，然后与3% H2O2孵育以消除内源性过氧化物酶活性。然后石蜡切片通过预热的EDTA溶液进行抗原修复。随后，用3% BSA封闭，并与Iba-1抗体（1:200, CST, USA）孵育。使用DAB试剂盒（Beyotime, 北京, 中国）可视化免疫反应性。通过光学显微镜观察切片。
2.10 Fluoro-Jade B Staining
用Fluoro-Jade B (FJB)（Merck, Germany）对脑切片进行染色以标记变性神经元。简要步骤如下：脱蜡和水化后，玻片用0.06% KMnO4氧化，冲洗，然后在0.001% FJB（溶于0.1%乙酸）中孵育30分钟。洗涤后，玻片干燥，二甲苯透明，并用DPX封片。使用带有FITC滤光片的荧光显微镜捕获图像。
2.11 mRFP-GFP-LC3 Adenovirus Analysis
为了评估自噬流（autophagic flux），用编码串联荧光标记LC3（mRFP-GFP-LC3）的重组腺病毒感染细胞。简要步骤如下：铺板细胞并以10的感染复数（Multiplicity of Infection, MOI）感染以获得最佳表达。24小时后，更换培养基，让细胞再表达24小时。使用激光扫描共聚焦显微镜进行活细胞成像。同时捕获GFP（pH敏感）和mRFP（pH稳定）信号。对自噬区室进行量化：黄色斑点（mRFP和GFP共定位）代表自噬体（autophagosomes），而仅红色斑点（mRFP信号无GFP）表示自噬溶酶体（autolysosomes），其中GFP荧光在酸性腔内被淬灭。
2.12 Transmission Electron Microscopy
为了对自噬泡进行超微结构分析，细胞首先用2.5%戊二醛（溶于0.1 M磷酸缓冲液）初级固定，然后用1%锇酸后固定。经过梯度乙醇系列脱水后，样品包埋在环氧树脂中。切割超薄切片，用醋酸铀酰和柠檬酸铅染色，并在透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope, TEM, Hitachi H-7650）下观察。自噬结构，包括自噬体（含有细胞质材料的双膜囊泡）和自噬溶酶体（含有降解内容的单膜囊泡），被识别并量化每个细胞剖面中的数量。
2.13 Western Blot Analysis
使用在-80°C冷冻的海马组织进行蛋白质提取。所有蛋白质分析均在RIPA可溶性组分上进行，每个样品的蛋白质浓度通过BCA蛋白质定量试剂盒（Beyotime, 北京, 中国）检测。根据目标蛋白的分子量选择不同浓度的SDS-PAGE凝胶。取30 μg蛋白质样品进行SDS-PAGE，电压120 V，时间60分钟，然后在350 mA下转印至PVDF膜90分钟。蛋白质转印后，膜用5% BSA在室温下封闭1小时，然后与特异性一抗孵育。所用的一抗包括来自Abcam（UK）的NeuN、PSD95（突触后密度蛋白95）、Beclin-1（Bcl-2相互作用蛋白）、P62（sequestosome-1, SQSTM1）和ATG5（自噬相关蛋白5）；来自Thermo Scientific的Tau（1:1000，反应于人tau；表位：aa 159–163）；使用磷酸化特异性抗体（1:1000, Immunoway PS396-1）检测Ser396位点磷酸化的Tau。来自CST（USA）的Iba-1、NLRP3（核苷酸结合域和富含亮氨酸重复序列蛋白3）、ASC（含CARD的凋亡相关斑点样蛋白）、Caspase-1（半胱氨酸依赖性天冬氨酸特异性蛋白酶）和LC3（微管相关蛋白1轻链3）；以及来自华安生物技术（中国）的GFAP（胶质纤维酸性蛋白），稀释比例均为1:1000。然后将膜与HRP标记的二抗（1:1000, Abcam, UK）在37°C孵育2小时，并使用ECL化学发光试剂盒（Thermo Fisher, 上海, 中国）进行显影。
2.14 Statistical Analysis
使用SPSS 24.0和GraphPad Prism 8.0进行统计分析。使用Shapiro–Wilk检验评估数据的正态性（对于样本量n<50）。对于符合正态分布的数据（p>0.05），采用单因素方差分析（One-way ANOVA） followed by Tukey's事后检验。当不满足参数检验的假设时，将应用Kruskal–Wallis检验进行统计分析。结果以均值±标准差（mean ± standard deviation, SD）表示。统计学显著性定义为p<0.05。
3 Results
3.1 β-Asarone Treatment Improved Cognitive Function in 3×Tg-AD Mice
β-细辛醚的化学结构如图1A所示。实验流程和给药细节如图1B所示。莫里斯水迷宫（MWM）和跳台试验（Step-down test）是广泛用于评估小鼠认知功能的行为学方法。如图1C所示，与3×Tg-AD组相比，β-细辛醚给药显著降低了逃避潜伏期，统计学上显著的差异在第四天出现。与野生型（WT）对照组相比，3×Tg-AD小鼠定位平台的潜伏期延长，这种损伤被β-细辛醚治疗显著减轻。此外，3×Tg-AD小鼠的穿越平台次数、目标区域内的路径长度和在目标象限停留时间等参数均显著降低。β-细辛醚治疗显著逆转了这些缺陷（图1D–F）。代表性的游泳路径进一步证实，接受β-细辛醚的小鼠比3×Tg-AD组的小鼠更快、更直接地定位平台（图1G）。与这些发现一致，跳台试验显示，β-细辛醚干预后错误次数显著减少，跳下潜伏期增加（图1H,I）。总之，这些结果表明β-细辛醚治疗有助于增强3×Tg-AD小鼠的认知功能。
3.2 β-Asarone Treatment Ameliorated Pathological Injury and Neuron Loss in the Hippocampus of 3×Tg-AD Mice
HE染色的结果如图2A所示。在WT小鼠海马CA3区，组织显示出相当的厚度和高细胞密度，神经元排列整齐、紧密。细胞形态规则，结构完整性保持，边界清晰可见。相比之下，3×Tg-AD小鼠的海马神经元排列紊乱，形态不规则，神经元间间隙增大，细胞病理学变化加剧。
使用免疫荧光和western blot检测Neun的表达，结果显示3×Tg-AD组小鼠海马中Neun显著降低，β-细辛醚干预后表达可得到改善（图2E–G,I）。同时，通过western blot检测PSD95，结果如图2G,H所示，3×Tg-AD组小鼠海马中表达显著降低，β-细辛醚干预后可增加。如图2J,K所示，模型组FJB阳性细胞密度显著增加。相反，药物治疗显著减弱了这种增加，导致阳性细胞密度显著降低。这些结果表明，β-细辛醚治疗显著改善了3×Tg-AD小鼠海马的病理损伤和神经元丢失。
3.3 β-Asarone Treatment Ameliorated Characteristic Protein Expression of AD in the Hippocampus of 3×Tg-AD Mice
Aβ的沉积和Tau蛋白的过度磷酸化是AD的标志性特征。通过免疫荧光评估Aβ产生的前体蛋白淀粉样前体蛋白（Amyloid-beta Precursor Protein, APP），结果如图3A,B所示。利用Western blot技术分析APP和Tau磷酸化的表达水平，结果如图3C–F所示。我们的研究结果表明，β-细辛醚治疗导致Aβ、APP和Tau磷酸化的表达降低，从而表明β-细辛醚改善了3×Tg-AD小鼠中AD的特征性蛋白表达。
3.4 β-Asarone Treatment Alleviated the Neuroinflammation in the Hippocampus of 3×Tg-AD Mice
神经炎症在AD中起着关键作用，导致神经元丢失、Aβ积累和tau蛋白过度磷酸化。免疫组织化学分析显示，3×Tg-AD小鼠海马中Iba-1+小胶质细胞显著增加（图4A,B）。与此一致，Western blot结果表明转基因动物中Iba-1和GFAP（反应性星形胶质细胞的标志物）均上调（图4C–E）。值得注意的是，β-细辛醚治疗显著降低了这些神经炎症标志物的表达。进一步支持其抗炎作用，ELISA分析表明β-细辛醚显著降低了海马中IL-1β、IL-18和TNF-α的水平。总之，这些发现表明β-细辛醚减轻了3×Tg-AD小鼠的神经炎症。
3.5 β-Asarone Treatment Inhibited NLRP3 Inflammasome Activation and Activated Autophagy in the Hippocampus of 3×Tg-AD Mice
NLRP3炎症小体的激活导致促炎细胞因子如IL-1β和IL-18的分泌。相反，自噬的诱导可抑制NLRP3炎症小体激活，从而减轻过度的炎症反应。Western blot评估的结果表明，3×Tg-AD小鼠中与NLRP3炎症小体相关的NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白水平显著升高，β-细辛醚治疗后所有这些标志物均显著降低（图5A–E）。在自噬相关标志物方面，3×Tg-AD小鼠中P62表达显著增加，而LC3-II/I比值、Beclin-1和ATG5表达显著降低。值得注意的是，这些改变在β-细辛醚治疗后是可逆的（图5F–J）。因此，上述指标共同证实β-细辛醚抑制NLRP3炎症小体激活同时促进自噬。
3.6 β-Asarone Treatment Inhibited Microglia Apoptosis and Neuroinflammation Induced by Aβ
小胶质细胞是主要负责产生炎症细胞因子的先天免疫细胞。因此，我们将研究重点放在β-细辛醚对小胶质细胞的影响上。首先，我们确定了β-细辛醚的合适剂量。如图6A,B所示，低于80 μg/mL的β-细辛醚浓度不影响小胶质细胞活性，而超过80 μg/mL的浓度显著抑制细胞活性。同时，使用25 μM Aβ25-35培养细胞以模拟与AD相关的小胶质细胞环境，结果显示10、20和40 μg/mL剂量的β-细辛醚能有效调节小胶质细胞反应。
10、20和40 μg/mL浓度的β-细辛醚给药显著增强了细胞活力，这促使我们选择这些特定剂量进行后续细胞实验。使用流式细胞术评估β-细辛醚对小胶质细胞凋亡的影响。研究结果表明Aβ促进小胶质细胞凋亡，而β-细辛醚在富含Aβ的环境中有效降低了凋亡率（图6C,D）。随后，我们继续通过细胞实验研究β-细辛醚在神经炎症中的作用。在Aβ环境下，免疫荧光分析显示Iba-1表达显著增加，β-细辛醚治疗后显著降低（图6E,F）。此外，ELISA结果证实，在Aβ条件下，小胶质细胞上清液中的炎症细胞因子IL-1β和IL-18水平显著升高，β-细辛醚干预后这些细胞因子降低（图6G,H）。这些结果共同证明β-细辛醚给药减轻了与小胶质细胞激活相关的神经炎症。
3.7 β-Asarone Treatment Inhibited NLRP3 Inflammasome Activation and Activated Autophagy in Microglia Induced by Aβ
进行Western blot检测NLRP3炎症小体和自噬相关蛋白的表达。实验结果显示，模型组中与NLRP3炎症小体相关的NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白表达显著增加，β-细辛醚治疗后这些指标均显著下降（图7A–E）。至于自噬相关指标Beclin-1、LC3-II/I比值、P62和ATG5，Aβ组Beclin-1表达显著降低，而LC3-II/I比值、P62和ATG5表达显著增加。Aβ组这些指标的变化趋势在β-细辛醚治疗后可以逆转（图7F–J）。因此，上述指标证实β-细辛醚治疗抑制了Aβ诱导的小胶质细胞中NLRP3炎症小体激活并激活了自噬。
3.8 Inhibition of Autophagy Attenuated the Inhibitory Effect of β-Asarone on NLRP3 Inflammasome in Microglia Induced by Aβ
为了进一步确认β-细辛醚是否通过激活自噬来抑制NLRP3炎症小体。同时用β-细辛醚和自噬抑制剂3-MA处理BV2细胞。结果显示，3-MA减弱了β-细辛醚对NLRP3、ASC、Caspase-1和cle-Caspase-1的抑制作用（图8A–E）。同时，3-MA可以阻断β-细辛醚对LC3-II/I比值、Beclin-1和Atg5的增加作用，并阻断β-细辛醚对P62的降低作用（图8F–J）。TEM和mRFP-GFP-LC3腺病毒荧光测定均证明自噬活性发生改变（图8K–N）。模型组自噬体数量显著减少。相反，药物治疗显著增加了自噬体形成。这种增加被自噬抑制剂3-MA有效消除，3-MA再次显著降低了自噬体计数。此外，我们使用NLRP3抑制剂MCC950来验证它是否会影响β-细辛醚对自噬的作用。结果显示MCC950不能抑制β-细辛醚对自噬的激活作用（图S1）。总之，这些实验结果表明，自噬抑制削弱了β-细辛醚对抗Aβ诱导的小胶质细胞中NLRP3炎症小体激活的功效，从而表明β-细辛醚通过激活自噬发挥作用。
4 Discussion
AD的发病机制仍不确定，包括Aβ沉积、Tau蛋白过度磷酸化、胆碱能功能障碍和兴奋性氨基酸毒性等理论。其中，自噬过程紊乱和神经炎症也被认为是重要原因。β-细辛醚已被证明可调节AD中涉及的多种途径，包括赋予神经保护、刺激脑源性神经营养因子（Brain-Derived Neurotrophic Factor, BDNF）的产生和释放、减弱Aβ聚集和斑块形成、促进神经发生以及抑制神经炎症反应。一些研究表明其作用机制与激活自噬有关。我们当前的研究重点是β-细辛醚是否可以通过激活自噬过程来减少神经炎症的发生。
在本实验中，我们使用了3×Tg-AD小鼠。这些小鼠是通过将APPSwe和TauP301L基因组合到PS1M146V突变小鼠中培育而成，构建的3×Tg-AD小鼠能够以年龄相关的方式形成淀粉样斑块、神经原纤维缠结和突触功能障碍。目前，它是与AD病理特征最接近的转基因动物模型。为了评估认知表现，采用MWM和跳台试验评估β-细辛醚对3×Tg-AD小鼠认知的影响。结果表明β-细辛醚给药显著增强了该AD模型的认知功能。
研究表明AD患者在整个大脑中经历大量的神经元丢失。本实验中，使用HE染色观察海马CA3区和皮层神经元的形态以确定神经元损伤程度。海马CA3区对空间记忆的形成至关重要，它可以支持空间任意关联的形成、空间工作记忆的暂时维持和空间模式的完成。因此，我们选择CA3作为观察对象。尼氏体广泛分布于神经元胞体或树突中，其主要功能是合成细胞所需的各种蛋白质，包括结构蛋白、神经递质和各种酶。尼氏体的数量可以反映神经元的功能状态。神经元核抗原（Neuronal Nuclei, NeuN）是公认的标志物，仅在分裂后神经元中检测到，并在特定发育阶段稳定表达，被认为是成熟神经元的可靠生物标志物。在本实验中，β-细辛醚干预后，海马神经元的核固缩、胞质嗜酸性增强和结构完整性均得到显著改善，尼氏体数量增加，表明受损神经元得到改善。同时，使用Western Blot和免疫荧光检测3×Tg-AD小鼠海马中NeuN和PSD95的表达。结果显示3×Tg-AD小鼠海马中NeuN和PSD95表达降低，而β-细辛醚可增加3×TG-AD小鼠海马中NeuN的表达。NeuN和PSD95的减少独立地证实了神经元丢失，支持了HE/尼氏染色的发现。与此一致，Fluoro-Jade B (
