《Molecular Oncology》：Genetic attenuation of ALDH1A1 increases metastatic potential and aggressiveness in colorectal cancer
编辑推荐：
本研究通过CRISPR-Cas9技术构建ALDH1A1基因敲除的结直肠癌（CRC）患者来源细胞系模型，发现ALDH1A1表达下调可显著增强癌细胞迁移能力与远处转移倾向，同时伴随皮下移植瘤生长减缓。分子机制研究表明该现象与Wnt信号通路失调、上皮-间质转化（EMT）标志物表达改变及干细胞特性重塑密切相关，为ALDH1A1在CRC转移中的双刃剑作用提供了新证据。
研究背景与意义
结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）在全球癌症发病率中位居第三，死亡率排名第二。患者来源的肿瘤模型在肿瘤生物学研究中具有不可替代的价值。本研究从一例直肠腺癌组织成功建立了一株过度表达癌症干细胞标志物ALDH1A1的人上皮细胞系（命名为pts80），并利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建ALDH1A1敲除模型，系统研究该基因对肿瘤细胞特性的影响。
细胞模型构建与表征
研究团队对82岁欧洲男性患者的直肠中分化管状腺癌组织（病理分期pT3N0MX）进行原代培养，建立pts80细胞系。该细胞系表现出典型上皮形态，倍增时间为18.6小时，具有迁移能力且对5-氟尿嘧啶（5-FU）和奥沙利铂敏感。免疫表型分析显示细胞高表达上皮细胞粘附分子（EpCAM, 79%）、E-钙粘蛋白（93%）和CD44（99%），30%细胞表达转移相关标志物CD44v6。
基因组特征分析
通过全外显子测序（WES）和拷贝数变异（CNV）分析发现，原发肿瘤组织存在染色体1、3、6、7、8、9、10、11q、13q和20的扩增，以及4q、8p、15q和18号染色体的缺失。特别值得注意的是，9号染色体的扩增导致ALDH1A1基因拷贝数增加。pts80细胞系携带68个可能致病性体细胞突变，包括TP53（C135Y）、BRAF（G466E）和SMAD6（Y476C）等CRC相关驱动基因突变。
ALDH1A1基因编辑与验证
研究设计了三组特异性引导RNA（gRNA）靶向ALDH1A1基因的启动子区和编码区，通过慢病毒载体介导的CRISPR-Cas9系统成功构建两个ALDH1A1敲除克隆（1C3 KO和1B6 KO）。测序验证显示基因编辑效率显著，1C3 KO和1B6 KO的ALDH1A1 mRNA表达分别降至亲本细胞的6.38%和8.78%。ALDEFLUOR检测证实敲除细胞的醛脱氢酶活性显著降低。
功能表型变化
体外实验显示，ALDH1A1敲除细胞的软琼脂克隆形成能力和结肠球形成能力显著降低，但细胞迁移能力明显增强。凋亡检测表明基因编辑未引起细胞死亡增加。体内实验证实，虽然ALDH1A1敲除细胞形成的皮下移植瘤生长速度减缓，但表现出更强的转移潜能：100%的敲除细胞移植小鼠出现腹腔多器官转移，而亲本细胞组仅50%出现微转移。
分子机制探索
RNA测序分析发现，ALDH1A1敲除导致12个关键基因表达显著改变。其中，与侵袭转移正相关的基因（TMTC1、CTH、STC1、SMOX）上调，而与细胞分化粘附相关的基因（TBXAS1、BCAS1、LARGE1、CYP3A5等）下调。基因集富集分析（GSEA）表明，维生素D代谢和Wnt信号通路是主要受影响通路。同时，ALDH1A1敲除导致视黄酸（Retinoic Acid, RA）应答基因（CYP26A1、RARRES、RARα等）表达下调，干细胞标志物OCT4、Nestin和EMT调节因子SNAI2表达上调。
结论与展望
本研究首次利用CRISPR-Cas9技术证实ALDH1A1在结直肠癌中的双重作用：高表达时促进肿瘤生长，而表达抑制时则增强转移能力。这种表型转换与Wnt信号通路失调、视黄酸代谢紊乱以及上皮-间质转化进程加速密切相关。pts80细胞系及其基因编辑模型为深入研究结直肠癌干细胞特性、转移机制及靶向治疗提供了重要平台。该发现对临床预后判断和治疗策略制定具有启示意义，提示ALDH1A1可能作为结直肠癌转移风险评估的生物标志物。
