《LWT》：Co-folding of buckwheat protein and shellac for develop W/O/W emulsions: enhanced encapsulation and gastrointestinal protection of
Lactiplantibacillus plantarum
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本研究针对益生菌在胃肠道环境中存活率低的技术瓶颈，创新性地利用荞麦蛋白与虫胶共折叠形成pH响应性复合物，成功构建了具有"油层物理屏障+界面吸附保护"双重机制的W/O/W乳液递送系统。该体系使植物乳杆菌包封率达到95.56%，经体外模拟胃肠消化后活菌数保持在7.5 log CFU/mL，显著高于游离细胞（4.0 log CFU/mL），为功能性食品开发提供了新策略。
在追求健康的现代社会中，益生菌作为调节肠道微生态平衡的活微生物，其功能性功效日益受到重视。植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）因其具有免疫调节、胆固醇代谢调控和心血管疾病预防等多重健康益处，成为研究和应用的热点。然而，这些对健康有益的微生物在抵达肠道发挥作用前，必须经历胃酸、胆盐和消化酶等多重严酷考验。国际乳品联合会建议，益生菌产品中活菌数需达到107CFU/g或mL以上才能在目标部位定植并发挥功效，但恶劣的胃肠道环境往往导致益生菌大量死亡，严重制约其实际应用效果。
传统的微胶囊化技术如电纺丝、冷冻干燥和喷雾干燥等，虽然在一定程度上能够保护益生菌，但过程中的极端温度、机械力作用会损害菌体活性，且高昂的操作成本限制了工业化大规模生产。相比之下，乳液包封技术以其温和的加工条件和成本效益优势，为益生菌保护提供了新思路。特别是水/油/水（W/O/W）型双乳液，其独特的"两膜三相"结构能够将亲水性益生菌包裹在内水相，通过油层和界面膜的双重阻隔，实现微生物在恶劣环境下的保护与控释。
荞麦蛋白作为一种营养均衡的植物蛋白源，含有13%-17%的优质蛋白，其氨基酸组成合理，尤其富含赖氨酸和精氨酸。研究表明，荞麦蛋白在体外消化过程中能显著增强抗氧化活性并抵抗消化酶降解，这种天然的抗消化特性恰恰为益生菌递送系统提供了理想载体。与此同时，虫胶作为一种天然树脂，被美国FDA认定为安全的食品添加剂（E904），其分子结构中同时含有疏水性和亲水性基团，且具有pH依赖性溶解特性（pKa 6.9-7.5），能够在酸性胃环境中保持稳定，在肠道条件下释放内容物，这种智能响应性使其成为理想的包封材料。
浙江中医药大学的研究团队基于前期研究发现，荞麦蛋白与虫胶共折叠形成的复合物能显著提高植物乳杆菌冻干后的储存稳定性。在此基础上，他们进一步探索将这种复合物应用于W/O/W双乳液体系，系统研究共折叠pH值和虫胶浓度对复合物理化性质及乳液稳定性的影响，旨在开发一种高效、安全的益生菌胃肠道保护递送系统。相关研究成果发表在《LWT》期刊上。
本研究采用的主要技术方法包括：通过pH偏移结合透析法制备荞麦蛋白-虫胶共折叠复合物；利用紫外光谱、荧光光谱和傅里叶变换红外光谱分析分子间相互作用；通过透射电子显微镜观察复合物形态；采用激光粒度分析仪和Zeta电位仪测定乳液粒径分布和稳定性；通过体外模拟胃肠消化模型评估益生菌存活率；运用共聚焦激光扫描显微镜观察乳液微观结构和细菌活性。
3.1 共折叠BW-虫胶复合物的表征
研究人员通过光谱分析发现，虫胶的加入显著改变了荞麦蛋白的紫外吸收特性，在280 nm附近吸收增强，表明虫胶与蛋白质芳香族氨基酸残基发生有效相互作用。荧光光谱显示复合物荧光强度明显淬灭，最大发射波长发生红移，说明色氨酸残基微环境极性增加，蛋白质构象发生重排。FTIR光谱进一步证实了氢键的形成，酰胺II带从1542 cm-1蓝移至1549 cm-1，表明荞麦蛋白的氨基与虫胶的羧基之间存在静电相互作用。
透射电镜观察显示，单纯pH处理的荞麦蛋白呈现球形单体和松散聚集颗粒的混合物，而BW-虫胶复合物则形成独特的纤维状形态伴随较小球形颗粒，这种双重形态有助于形成更均匀致密的界面层。在pH 9条件下制备的BWS-1复合物表现出最优异的性能，其ζ电位达到-61.4±1.17 mV，表明具有极强的静电排斥力和胶体稳定性。乳化活性指数和乳化稳定性指数测定结果表明，虫胶的加入显著改善了荞麦蛋白的乳化性能，其中pH 9、蛋白与虫胶质量比1.5:1的样品表现最佳。
3.2 BW-虫胶复合物基W/O/W乳液的性质
乳液粒径分布分析显示，随着荞麦蛋白含量的增加，乳液液滴尺寸普遍增大，但pH 9条件下制备的乳液具有更窄的粒径分布，特别是BWS-1和BWS-1.5样品液滴尺寸显著小于pH 7的对应样品。共聚焦显微镜观察证实了乳液的成功构建，内水相呈绿色被红色油滴包裹，进一步嵌入绿色外水相中，界面处出现的黄色荧光表明BW-虫胶复合物成功吸附在油水界面。
包封效率测定结果显示，所有BW-虫胶复合物稳定的W/O/W乳液对植物乳杆菌的包封效率均超过80%，多数样品达到91-95%的高效率。这种高包封性能归因于BW-虫胶相互作用形成的纤维网状结构，增强了乳液滴的稳定性。然而，当蛋白与虫胶质量比从2增加到5时，包封效率明显下降，可能与过量蛋白导致乳液体系发生絮凝或聚集有关。
益生菌在体外模拟胃肠道消化中的存活情况
体外模拟胃肠消化实验结果表明，游离的植物乳杆菌经过胃肠道处理后，活菌数从8.77±0.04显著下降至4.02±0.05 log CFU/mL。相比之下，所有BW-虫胶复合物稳定的乳液均显著提高了益生菌存活率，表明W/O/W乳液为植物乳杆菌抵抗胃酸、胆盐和消化酶提供了保护性微环境。
乳液的油相作为物理屏障，隔离了益生菌与严酷胃液的直接接触。同时，pH响应的BW-虫胶复合物显著减少了蛋白质水解，其中pH 9条件下制备、虫胶比例较高的乳液赋予的保护效果最优。微观结构演变观察显示，在胃相消化阶段，双乳液因其酸抗性而保持多层结构；在肠相消化2小时后结构仍能维持，4小时后才出现逐渐崩解。活死菌染色结果显示绿色荧光占主导，表明存活益生菌多于死亡菌体，完整乳液滴内的植物乳杆菌被AO染成绿色，证实了控释递送效果。
本研究成功开发了一种由pH响应性荞麦蛋白-虫胶复合物稳定的新型W/O/W双乳液系统，显著增强了植物乳杆菌的包封率和胃肠道保护效果。在碱性pH 12条件下荞麦蛋白与虫胶共折叠促进了分子间相互作用，形成了具有改善乳化性能的纤维状复合物。特别优化的pH 9 BWS-1复合物表现出优异的乳化活性（EAI为164.74 m2/g）和胶体稳定性（ζ电位-61.4 mV）。BW-虫胶复合物稳定的乳液实现了高包封效率（91-95%），并在体外消化过程中有效保护益生菌，维持高活菌数达8.5 log CFU/mL，显著高于游离细胞（4.0 log CFU/mL）。油层物理屏障和BW-虫胶复合物界面吸附的双重稳定机制确保了益生菌的控释和pH依赖性保护。这些结果突显了谷物蛋白-虫胶复合物作为可扩展、食品级递送系统用于敏感生物活性化合物的潜力，为解决益生菌功能性食品开发中的关键挑战提供了新方案。
