《Cell Proliferation》：Application Strategies of Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cells in Bone-Related Diseases
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本综述系统阐述了骨髓间充质基质细胞(BMSCs)在骨质疏松、骨关节炎等骨相关疾病治疗中的最新进展，重点探讨了基因编辑(CRISPR-Cas9)、预处理策略、组织工程(3D支架)、细胞外囊泡疗法和表观遗传调控(组蛋白修饰)等前沿技术如何增强BMSCs的治疗效果，并展望了类器官与3D生物打印等技术的临床应用前景。
骨髓间充质基质细胞：骨疾病再生治疗的新希望
ABSTRACT
骨相关疾病（如骨质疏松、骨关节炎和骨折）的全球发病率持续上升，给生活质量和医疗系统带来沉重负担。传统治疗方法包括抗吸收药物和手术干预，但面临长期用药、不良反应（如双膦酸盐相关颌骨坏死）和疗效欠佳等局限。骨髓间充质基质细胞（BMSCs）因其易获取性、多向分化潜能、免疫调节特性和归巢能力成为有前景的治疗替代方案。近年来，基因工程、预处理策略、骨组织工程（如三维支架）、基于细胞外囊泡的疗法和表观遗传调控（如组蛋白修饰）等技术的进步显著增强了BMSCs的治疗效果。此外，类器官和3D生物打印等尖端技术为临床应用开辟了新途径。
1 引言
骨相关疾病（包括骨质疏松、骨关节炎、骨折和骨缺损）在全球范围内日益普遍，以慢性疼痛、身体残疾和功能障碍为特征，产生深远的社会经济影响。BMSCs由Friedenstein首次描述，是骨关节疾病临床研究中广泛使用的细胞类型。作为多能基质细胞，BMSCs具备三大特征：分化为成骨细胞和软骨细胞的能力、免疫调节功能以及归巢和迁移能力。这些特性使其在维持骨稳态、对抗病理性骨丢失和促进再生中发挥核心作用。为克服BMSCs体内疗效不一致等挑战，基因编辑技术（如CRISPR-Cas9）、细胞工程方法（如药理/生化预处理）、组织工程解决方案（如先进生物材料支架）和衍生疗法（如基于细胞外囊泡的治疗）等多种干预策略被探索应用。
2 BMSCs的研究基础
2.1 BMSCs的分离与鉴定
BMSCs主要通过骨髓贴壁法、密度梯度离心法或骨消化法分离。其中骨髓贴壁法因BMSCs固有的塑料贴壁特性及操作相对简单而最为常用。表型鉴定需符合国际细胞与基因治疗学会（ISCT）的最新共识标准，细胞应持续表达核心阳性标志物（CD73、CD90和CD105，阳性率>95%），且严格阴性表达CD45（阳性率<2%）。单细胞RNA测序等新技术增强了BMSCs的特征分析，能够在单细胞分辨率下分析基因表达，识别不同细胞亚群。
2.2 BMSCs的增殖与分化能力
BMSCs在体外稳定扩增的能力使其成为基础研究和临床转化的理想平台。但其增殖活性受培养基成分、氧分压、基质硬度和操作影响等多种因素影响。BMSCs的成骨分化涉及Wnt/β-连环蛋白、TGF-β/Smad、PI3K/AKT和MAPK等关键信号通路的激活，上调RUNX2、Osterix、ALP、COL1A1、OPN和OCN等成骨标志物的产生。此外，表观遗传修饰（如DNA甲基化、m6A RNA甲基化和组蛋白修饰）和非编码RNA（如miRNA和lncRNA）也发挥关键作用。BMSCs在特定诱导条件下可进行成脂分化，其特征是脂滴积累和PPARγ、C/EBPα等成脂标志物的表达。值得注意的是，成骨和成脂分化之间存在关键的逆关系。在肥胖、衰老或骨质疏松情况下，BMSCs的成骨分化能力下降而成脂分化增加，这种失衡被认为是骨丢失的关键病理机制。在三维培养环境中，BMSCs可分化为软骨细胞，合成II型胶原和蛋白聚糖，为软骨基质形成和损伤软骨修复提供基础。
2.3 BMSCs的抗炎和免疫调节能力
BMSCs通过直接的细胞-细胞接触和广泛的旁分泌信号传导发挥抗炎和免疫调节作用。它们可调节T细胞、B细胞、自然杀伤（NK）细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞和中性粒细胞等多种免疫细胞。具体而言，BMSCs抑制效应T细胞（如Th1和Th17）增殖和促炎细胞因子分泌，同时促进调节性T细胞分化以增强免疫耐受。免疫调节通过多种机制发生，包括通过连接蛋白（如Cx-43和Cx-45）形成直接的间隙连接，以及通过分泌细胞因子和细胞外囊泡（如外泌体）进行旁分泌活动。关键介质包括吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、前列腺素E2（PGE2）、白细胞介素-6（IL-6）、转化生长因子-β1（TGF-β1）、TNF刺激基因6蛋白（TSG6）和人类白细胞抗原-G5（HLA-G5）。
2.4 BMSCs的归巢和迁移能力
MSCs的归巢是指其从血管系统跨内皮屏障定向迁移到特定损伤部位的过程，是生物体中关键的自我修复机制。BMSCs表达多种功能性趋化因子受体，包括CC趋化因子受体（CCR1、CCR7和CCR9）和CXC趋化因子受体（CXCR4、CXCR5和CXCR6）。它们的迁移还受炎症细胞因子（如TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8）和生长因子（如VEGF-A、FGF、PDGF-AB、HGF、TGF-β1、SDF和IGF-1）的调节。原位BMSCs在骨骼发育、重塑和再生中起关键作用。在骨骼发育早期，它们作为成骨细胞和软骨细胞的直接祖细胞，积极驱动骨和软骨的形成与生长。骨骼生长减慢或停止后，BMSCs可进入可逆的静止状态，作为长期储备库，在被激活时增殖和分化，通过持续重塑维持骨稳态。
3 BMSCs在骨相关疾病中的应用
3.1 骨质疏松
BMSCs的功能障碍在骨质疏松发病机制中起核心作用，主要表现为细胞衰老、成骨-成脂平衡受损和骨重塑 disrupted。恢复BMSCs的成骨潜力已成为关键治疗策略。当前方法包括通过基因编辑或药理干预直接激活成骨通路（如PI3K/AKT和Wnt/β-连环蛋白），通常通过过表达RUNX2等关键调节因子。同时，通过激活抗衰老通路（如SIRT1和AMPK）和增强自噬来靶向细胞衰老，可改善BMSCs的存活和分化能力。BMSCs来源的外泌体显示出显著的治疗潜力。BMSCs分泌的外泌体富含microRNA（如miR-29a和miR-146a）和细胞因子，通过调节巨噬细胞极化、增强血管生成和促进成骨分化等多种机制协调骨形成。
3.2 骨关节炎
骨关节炎（OA）是一种退行性关节疾病，主要通过保守方法管理。标准护理结合物理疗法（如肌肉强化和电疗）与药物治疗（如NSAIDs和皮质类固醇）以缓解症状。然而，这种方法只能缓解症状而不能阻止疾病进展。BMSCs在OA中发挥多方面的治疗作用，包括软骨基质修复、炎症抑制和关节微环境调节。它们通过调节涉及促炎信号、基质降解（通过MMPs）和Wnt信号的关键通路促进软骨再生。BMSCs的软骨源性分化——通过微环境线索（如缺氧和TGF-β）或基因修饰（如SOX9过表达）增强——刺激II型胶原和蛋白聚糖的合成，促进结构修复。虽然直接关节内注射BMSCs或EVs常用，但快速清除限制了其疗效。组织工程方法通过将细胞或囊泡封装在仿生支架（如透明质酸和复合水凝胶）中来解决这一问题。
3.3 骨折愈合
骨折通常通过手术固定处理。愈合过程涉及三个连续阶段：炎症反应、骨痂形成和骨性骨痂重塑，其中免疫调节和充足的血液供应起关键作用。BMSCs通过多种机制促进骨折修复。移植后，它们促进M2巨噬细胞极化和抗炎因子（如IL-10和TGF-β）的分泌，从而减轻过度炎症并建立有利于成骨的微环境。此外，通过旁分泌信号结合PDGF和血管内皮生长因子（VEGF）等生长因子，BMSCs增强血管生成，改善局部营养供应并支持骨再生。组织工程策略进一步扩展了BMSCs的治疗潜力。负载BMSCs或衍生囊泡的仿生支架（例如羟基磷灰石-胶原复合材料）提供机械支撑和骨传导信号，同时模拟天然骨结构。
3.4 药物相关性颌骨坏死（MRONJ）
MRONJ定义为口腔内存在暴露的坏死骨，症状持续且难治超过8周，患者未接受放疗。该疾病涉及众多风险因素，包括免疫力低下、创伤和病毒感染，但与抗吸收药物，特别是含氮双膦酸盐（BPs）的使用密切相关。目前管理主要依赖保守的非手术方法来减缓疾病进展。目前，BMSCs移植结合综合疗法似乎是MRONJ有前景的治疗策略。研究表明，BMSCs通过协同的多机制作用对MRONJ产生显著治疗效果。在动物疾病模型中，BMSCs移植已显示通过免疫调节功能治疗MRONJ。BMSCs的治疗效果可能与细胞间线粒体转移有关，为受损组织提供能量支持并促进细胞存活。此外，BMSCs来源的外泌体作为关键的旁分泌介质，携带各种生物活性分子协调调节骨稳态。
4 基于BMSCs的治疗策略
4.1 BMSCs的基因工程修饰
基因编辑技术（如CRISPR-Cas9、TALENs和锌指核酸酶）和病毒载体（如慢病毒和腺相关病毒）能够精确修饰BMSCs中的特定基因，增强其成骨分化、增殖能力和归巢能力，为治疗骨相关疾病提供了新途径。CRISPR-Cas9系统因其高精度、效率和特异性被广泛使用，促进BMSCs中多基因靶向以调节干性、衰老、迁移和分化。例如，敲除抑制成骨分化的基因（如PPARγ）或过表达促成骨基因（如BMPs和RUNX2）可显著增强BMSCs的成骨潜力。
4.2 条件性预处理
条件性预处理——使用化学、药理或环境刺激——有效调节BMSCs行为以增强抗炎、再生和适应功能，已成为治疗骨质疏松和骨关节炎的关键策略。3D培养环境（如脱细胞基质、3D打印生物材料）提供空间结构和细胞-细胞接触点，比传统二维培养更有效地调节BMSCs表型、增殖、迁移和蛋白质表达。低氧预处理通过模拟生理低氧生态位增强BMSCs的血管生成能力、葡萄糖代谢、增殖和存活。低氧诱导因子-1α（HIF-1α）的上调增强自噬并减少骨质疏松条件下的细胞凋亡。药理预处理通过细胞保护、抗炎和促分化作用增强BMSCs功能。褪黑素减轻氧化应激和衰老，上调RUNX2表达并支持线粒体功能以促进骨再生。N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）预处理提高谷胱甘肽水平，改善氧化应激抵抗和成骨作用。他汀类药物（如辛伐他汀）刺激BMP-2表达并抑制PPARγ，有利于成骨而非成脂分化。
4.3 组织工程与类器官技术
组织工程通过整合生物材料、基质细胞（如BMSCs）和生物活性因子构建功能性仿生替代物，代表了骨修复和软骨再生的创新治疗策略。核心概念在于利用生物材料模拟体内微环境，同时与BMSCs的增殖和分化能力协同作用。通过控制药物、因子或囊泡的递送以及调节材料特性，“支架-细胞-因子”系统能够实现多维再生治疗。类器官技术为组织修复提供了新机遇。类器官定义为通过基质细胞自我组织形成的3D结构，它们包含器官特异性细胞类型，并通过细胞分选和空间限制的谱系定型等过程模拟关键的体内组织特征。
4.4 BMSCs来源的囊泡
BMSCs来源的囊泡（外泌体、微囊泡和凋亡小体）通过避免血管阻塞、肿瘤形成和免疫原性风险，提供了比细胞疗法更安全、更多功能的无细胞治疗替代方案。BMSCs来源囊泡的治疗潜力源于它们从亲代细胞继承的细胞膜和细胞质成分，赋予它们类似的抗炎、免疫调节和组织再生治疗效果。作为细胞间信使，这些囊泡可将mRNA、miRNA、蛋白质和脂质转移至受体细胞，影响细胞代谢、存活、增殖和免疫反应等多种生物过程。尽管天然囊泡前景广阔，但面临不稳定性、低产量和分离效率欠佳等挑战。培养条件和预处理策略的优化可显著增强MSCs来源外泌体的产量和功能性。
4.5 靶向治疗策略
靶向治疗采用针对特定分子锚点的精确干预，从而增强治疗效果和特异性。BMSCs及其衍生囊泡在体内的靶向递送可显著提高利用效率和治疗结果。常用的靶向分子包括适体、肽和小分子探针，修饰机制基于特异性识别和生物相容性结合。适体由短核苷酸或肽序列组成，在识别从小分子到整个细胞的靶标方面表现出显著特异性。此外，肽能够精确控制氨基酸组成和序列。通过细胞双层与肽锚定模块之间的疏水相互作用或共价结合，可实现基质细胞表面的工程化外源修饰，提供适当的信号转导以增强MSCs归巢能力。
4.6 BMSCs的表观遗传修饰
表观遗传学是指在不改变核DNA序列的情况下发生的可逆和可遗传的基因表达变化。这些修饰包括DNA甲基化、RNA甲基化、组蛋白修饰、microRNAs（miRNAs）和非编码RNA，它们在调节BMSCs分化、增殖和衰老中起关键调控作用。表观遗传修饰与骨科疾病的发生发展密切相关。DNA甲基化是一个动态过程，受DNA甲基转移酶（DNMTs）、去甲基化酶（TETs）以及5-甲基胞嘧啶（5mC）和5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）等修饰的协调作用调节。该过程通过调控关键转录因子的表达关键影响BMSCs谱系定型。RNA甲基化，特别是m6A修饰，对mRNA产生复杂的调控效应，介导其翻译效率、稳定性和降解。组蛋白经历大量翻译后修饰（如甲基化、乙酰化、磷酸化、乳酸化、瓜氨酸化、巴豆酰化、琥珀酰化、SUMO化、丙酰化、丁酰化、2-羟基异丁酰化和2-羟基丁酰化），改变染色质结构和基因可及性。非编码RNA通过多种机制调控基因表达，包括转录和转录后调控。
5 BMSCs在骨相关疾病中的应用局限性
尽管BMSCs在再生医学中具有巨大潜力，但其临床应用仍受若干限制。主要限制是BMSCs的细胞异质性。指定为BMSCs的群体包含具有不同表型和功能特征的多个亚群。这种异质性受供体年龄、细胞来源和培养条件的影响，直接影响扩增潜力和稳定性。此外，BMSCs在维持干性方面面临挑战。随着长期培养或供体年龄增加，它们可能失去多能性、表现出过度增殖或分化为非靶细胞类型，损害治疗效果和安全性。此外，遗传不稳定性构成显著安全风险。长期培养可能导致染色体异常，增加肿瘤形成或功能异常的可能性。
移植后，移植的BMSCs遇到恶劣的损伤微环境，严重损害其存活和功能。损伤部位的恶劣微环境——以缺氧、炎症和免疫反应为特征——严重限制细胞存活。此外，BMSCs的归巢能力往往不足。静脉给药存在首过效应，且归巢相关受体（如CXCR4）表达下降损害定向迁移。此外，损伤微环境内的炎症因子和局部药物浓度进一步破坏归巢效率。
临床应用之路充满实际挑战。骨缺损的不规则性要求个性化的生物材料载体，而植入后监测细胞分布在技术上仍然困难。高成本和标准化问题是主要瓶颈。BMSCs的制备、扩增和基因修饰是昂贵的过程。通过骨髓穿刺获取自体细胞患者接受度低，而同种异体疗法需要严格的供体筛查，其标准化生产和质量控制体系尚不完善。最后，预测治疗结果很复杂，因为疗效受疾病类型、患者特异性因素和微环境影响，使得临床试验难以设计和解释。
6 结论
干细胞疗法作为当代医学中极具前景的细胞治疗方法，为解决骨组织相关疾病开辟了新途径。骨髓间充质基质细胞（BMSCs）作为关键的成骨前体细胞，在骨组织修复和再生研究中起决定性作用。大量研究阐明了BMSCs的细胞增殖、分化和代谢活动。通过深入探索其基因表达和调控机制、细胞间相互作用模式、囊泡分泌功能和信号通路，逐步揭示了BMSCs在骨质疏松、骨关节炎、骨折和药物相关性颌骨坏死等骨相关疾病的发病机制、临床管理和组织再生过程中的核心调控原则。这些基础研究发现不仅完善了基于BMSCs疗法的理论框架，也为细胞疗法后续临床转化提供了坚实的实验证据和科学支持。
然而，生物系统固有的复杂性为BMSCs的临床应用带来了重大挑战。一方面，BMSCs发育过程中信号网络的精确调控机制仍未完全明了，任何阶段的异常都可能损害其功能功效。另一方面，BMSCs在体外的分化结果和功能状态与其在体内真实组织微环境中的行为存在显著差异，难以准确预测其在体内的治疗效果。同时，BMSCs活性和功能可塑性的维持受供体年龄、培养条件和病理微环境等多种因素制约。这些问题共同限制了BMSCs临床结果的稳定性和可靠性。
为克服这些限制，研究人员积极整合多学科技术，制定了多样化的干预策略，显著增强了BMSCs及其衍生物的治疗效果。例如，为解决细胞存活率低、归巢效率差和功能不稳定等核心挑战，已制定多种策略以提高增殖、分化、迁移和存活能力，同时增强其衍生物的功能。这种从细胞疗法到非细胞疗法的多层次方法共同提升了BMSCs在骨相关疾病治疗中的应用。基因工程技术利用CRISPR-Cas9等工具精确编辑关键基因以优化BMSCs的归巢和分化能力。预处理技术采用低氧诱导和因子刺激等方法增强BMSCs的抗凋亡和旁分泌功能。组织工程技术结合3D打印创建仿生支架，为BMSCs提供机械支撑和分化微环境。靶向干预技术实现BMSCs及其衍生物的精确递送；表观遗传调控通过调节基因表达模式进一步释放治疗潜力。即使BMSCs移植后发生凋亡，工程化细胞也可在体内转化为工程化凋亡小体。这些囊泡继承了细胞的优越功能特性，发挥治疗作用并补偿凋亡细胞的功能损失。因此，无细胞疗法可有效作为体内细胞疗法的功能延续。
鉴于单一策略往往存在固有局限性，多种策略的整合通过功能互补产生协同效应，已成为主流研究范式。例如，将组织工程材料与囊泡结合可使纤维蛋白水凝胶维持并缓慢释放BMSCs来源的外泌体，从而调节软骨细胞功能；类似地，含钴生物活性玻璃支架可在提供结构支撑的同时模拟低氧微环境，促进血管生成和成骨。这些组合方法显著增强了BMSCs及其囊泡的治疗效果。针对BMSCs弥补不足的多策略整合代表了当前发展的最佳途径。当然，多策略整合也带来了新挑战，包括工艺复杂性增加、技术兼容性要求严格以及安全评估标准不一致，这将要求更高的技术开发标准。
展望未来，随着这些技术的不断创新和深度融合，BMSCs必将在骨组织相关疾病的精准治疗中发挥越来越关键的作用，推动细胞疗法迈向新高度。
