一种使用“双结扎”技术建立实验性大鼠牙周炎的优化方法

《Methods》：An optimized method for establishing experimental rat periodontitis using “double-ligature” technique

本研究开发新型“双结扎”技术结合丝绸缝线和正畸钢丝，辅以高糖饮食，成功建立稳定且严重的大鼠牙周炎模型，解决传统方法结扎线易松脱问题，为后续治疗研究提供可靠基础。

　　

程虎|王海霞|廖宇伟|胡晓丽

中山大学口腔医院、广东省口腔医学重点实验室及光华口腔医学院，中国广州510055

摘要

建立稳定可靠的实验性牙周炎动物模型对于深入理解牙周炎的病因、临床诊断和治疗至关重要。然而，传统的丝线结扎方法在诱导大鼠牙周炎时存在局限性，尤其是丝线容易脱落的问题。在本研究中，我们采用了一种新的“双结扎”技术，结合了丝线和正畸钢丝，并通过高糖饮食来增强效果，成功建立了可靠的大鼠牙周炎模型。30只大鼠被随机分为五组：对照组、仅使用钢丝组、仅使用丝线组、钢丝+丝线组以及钢丝+丝线+高糖组。两周后，钢丝+丝线+高糖组的临床指标（如牙周袋出血指数、探针深度、牙菌斑指数）显著高于对照组（*p* < 0.05），同时微CT显示牙槽骨吸收严重。分子分析表明双结扎组中炎症基因（如TNF-α、IL-1β）的表达上调。组织学检查证实存在广泛的免疫细胞浸润和牙周韧带破坏。这种联合方法诱导的牙周炎程度比对照组严重103%，TRAP染色显示破骨细胞活性增加了5倍。通过这种“双结扎”技术，一方面可以研究牙周炎的发病机制，另一方面可以验证生物材料对牙周炎引起的牙槽骨缺损的治疗效果。该方法克服了传统丝线结扎方法的局限性（如丝线脱落问题），为牙周炎的转化医学研究奠定了基础。

引言

牙周炎是一种慢性、非特异性的炎症反应，其特征是牙周组织的侵袭，是一种破坏性很强的疾病[1]。牙周炎是一种慢性炎症性疾病，会导致牙周支持组织的破坏，最终引发牙槽骨吸收和牙齿脱落。其发病机制是一个复杂的连续过程，受到口腔生物膜、宿主免疫反应和骨代谢之间相互作用的严格调控。阐明疾病进展的关键机制对于优化动物模型的构建和探索有效的治疗策略至关重要。牙周炎的研究与动物模型的开发密切相关。目前最常用的动物包括猴子、狗、兔子、大鼠和小鼠[2]、[3]。然而，由于大型动物实验的限制、社会和伦理问题以及小鼠口腔空间较小，大鼠模型在牙周病研究中的使用越来越普遍[4]、[5]。有多种方法可用于建立大鼠牙周炎模型，例如通过高糖粘性饮食[6]、口腔接种特定细菌[7]，或使用棉线、弹性橡皮筋、正畸钢丝等材料结扎牙齿的颈部，有时还会结合细菌涂层技术[8]、[9]。其中，最常用的方法是结扎诱导法[10]，即将丝状结扎物放置在下颌或上颌磨牙的颈部，这会导致细菌定植和大量生物膜积聚，从而模拟临床观察到的症状。目前使用丝线结扎的主要问题是它们容易脱落。一旦丝线脱落，牙周炎症会停止，需要将受影响的动物从实验组中移除，这会阻碍实验进展并导致动物资源的浪费。通常需要预先准备更多的动物以弥补实验过程中的损失。此外，一些研究仅使用正畸钢丝等材料结扎牙齿的颈部[11]，但这无法满足实验要求，因为正畸钢丝的光滑表面使得难以引发牙周炎或仅导致轻微的病变[12]。

其他研究则需要在大鼠牙周炎形成部位注射脂多糖（LPS），通常每周注射3次，持续4-8周[13]。然而，由于每次注射都需要对大鼠进行镇静，麻醉过量成为这些动物死亡的一个常见原因。

基于上述研究，本研究综合和改进了现有的建模方法，设计了一套新的仪器套装用于构建大鼠牙周炎模型。提出了一种新的诱导牙周炎的技术，能够在两周内在大鼠的牙槽骨中引发稳定且严重的牙周炎。

实验方法概述

动物与分组

野生型雄性SD大鼠（30周龄，体重300±20克）购自中山大学动物中心（中国广州）。所有动物均按照中山大学《实验动物护理和使用指南》（SYSU, China）的规定进行饲养。实验程序获得了中山大学动物护理和使用委员会（Approval No. SYSU-IACUC-2021–000535）的批准。这些动物在无特定病原体的清洁动物室中饲养。

实验器械的设计与制备

为了更好地构建大鼠牙周炎模型，我们首先设计了一些专用器械。如图1A所示，需要准备基本工具，包括丝线、针夹和镊子，还有一些特殊器械需要自行制作。需要将25#至40#的牙科镍钛根管锉预先弯曲。图1B展示的是0.2毫米的正畸结扎钢丝。我们使用了两根结扎钢丝进行实验。

讨论

目前已有多种方法可用于建立大鼠牙周炎模型，包括仅用结扎钢丝结扎牙齿颈部的1/3以保留牙菌斑、用结扎钢丝包裹牙齿颈部的1/3，或在饮食中添加高糖成分，或通过口腔接种特定细菌。最近的实验表明，这些方法可以引发牙周组织的炎症反应、牙周袋形成、牙菌斑积聚和牙槽骨丧失。

结论

总之，我们提出了一种新方法，结合了丝线和U形扭曲正畸钢丝，并辅以高糖饮食，成功建立了大鼠实验性牙周炎模型。这种方法显著降低了传统丝线结扎方法容易脱落的问题，使实验更加简便高效。重要的是，所有动物只需麻醉并接受一次手术处理，之后无需再进行其他操作。

注意事项

所有动物均按照中山大学《实验动物护理和使用指南》（SYSU, China）的规定进行饲养。实验程序获得了中山大学动物护理和使用委员会（Approval No. SYSU-IACUC-2021-000535）的批准。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：11772361）、广东省医学科学研究基金（项目编号：A2025297）以及广东省基础与应用基础研究基金（项目编号：2022A1515012531和2024A1515012222）的支持。