新型比色pH荧光探针用于可视化线粒体-溶酶体功能障碍及食品新鲜度检测

《Microchemical Journal》：Novel colorimetric pH fluorescent probe visualization mitochondrial-lysosomal dysfunction and food freshness

设计并合成四类基于苯并噁唑酮和苯并硫杂唑酮的pH响应荧光探针，其中Mi-Ly-1在酸性溶酶体（pH4.0-5.5）发射红光（605nm），在碱性线粒体（pH7.5-8.5）发射绿光（560nm），实现细胞器损伤可视化及食品pH检测。

　　

黄永飞|高子凡|范哲峰

教育部磁分子与磁信息材料重点实验室，山西师范大学化学与材料科学学院，太原 030032，中国

摘要

Mi-Ly-1、Mi-Ly-2、Mi-Ly-3、Mi-Ly-4）。其中，Mi-Ly-1 显示出显著的 pH 依赖性结构转变：在酸性溶酶体（pH 4.0–5.5）中发出红色荧光（λ_em = 605 nm），在弱碱性线粒体（pH 7.5–8.5）中发出绿色荧光（λ_em = 560 nm）。高皮尔逊共定位系数（与 MitoTracker 的共定位系数为 0.84，与 LysoTracker 的共定位系数为 0.81）证实了其对两种细胞器的精确靶向。利用 Mi-Ly-1，我们观察了在氯喹/氯醛刺激下以及由紫杉醇、罗丹明和秋水仙碱诱导的细胞凋亡过程中的细胞器损伤。除了细胞成像外，Mi-Ly-1 还能够在新鲜果汁中准确检测 pH 值，其结果与标准 pH 计测仪非常吻合。此外，基于 Mi-Ly-1 的试纸可以作为便携式检测工具，用于监测猪肉和虾在变质过程中的 pH 变化。这项工作提供了一种多功能分子工具，将细胞生物化学与食品科学相结合，实现了对两种细胞器的分析及实际新鲜度监测。

引言

在真核生物中，不同的细胞器具有不同的功能，并通过复杂的相互作用维持细胞稳态 [6]、[7]、[8]。作为两个重要的细胞器，线粒体和溶酶体在真核生物的生命过程中发挥着重要作用 [9]。线粒体是细胞的能量工厂，细胞呼吸和代谢过程发生在线粒体内 [10]。此外，线粒体还在信号传导和免疫反应中起着重要作用 [11]、[12]。线粒体功能异常可导致心血管疾病、阿尔茨海默病和癌症 [13]、[14]、[15]。溶酶体含有多种水解酶，负责分解细胞内的有害物质 [16]。溶酶体主要参与自噬、细胞凋亡、内吞作用等生命过程 [17]、[18]、[19]。溶酶体代谢紊乱可能诱发帕金森病 [20]。实际上，线粒体损伤和溶酶体损伤是两种不同的代谢途径：线粒体损伤主要是由于线粒体内的 ROS 和细胞色素释放到细胞质中，激活 caspase 从而引发细胞凋亡 [21]；而溶酶体损伤则是溶酶体酶释放到细胞质中导致细胞凋亡 [22]。因此，开发一种能够区分线粒体和溶酶体功能障碍的可视化方法有助于理解两者之间的复杂相互作用，进而揭示许多疾病的潜在机制。

自噬过程需要线粒体和溶酶体的共同参与 [23]。受损的线粒体会触发自噬体的吞噬作用，自噬体与溶酶体融合形成自溶酶体，后者会吞噬受损的线粒体 [24]。这有助于保持线粒体的正常功能，防止受损线粒体的积累。线粒体损伤通常表现为线粒体膜电位（ΔΨm）的下降 [25]。溶酶体损伤则会导致溶酶体 pH 值升高和溶酶体膜通透性（LMP）增加 [26]。荧光探针具有可视化效果好、灵敏度高和实时动态监测的优势，是研究细胞器相互作用的强大工具 [27]、[28]、[29]、[30]、[31]、[32]、[33]、[34]、[35]、[36]、[37]、[38]、[39]、[40]、[41]。尽管市面上有一些共染探针可用于同时观察和研究溶酶体与线粒体的相互作用 [42]、[43]、[44]，但这种方法需要将两种探针同时染色，这不可避免地会导致光谱串扰和繁琐的染色过程。而一种能够实现双色成像的单个荧光探针则是一种强大的化学工具，可以揭示复杂的细胞器相互作用，避免上述缺点 [45]。因此，开发一种能够实现双色成像并同时监测线粒体和溶酶体相互作用及功能障碍的新型单荧光探针仍是一项具有挑战性的任务。

在这里，我们基于丁香醛和苯并噻唑盐构建了一系列四种单荧光探针（Mi-Ly-1、Mi-Ly-2、Mi-Ly-3 和 Mi-Ly-4）。其中，Mi-Ly-1 显示出明显的 pH 响应，在线粒体中发出红色荧光，在溶酶体中发出绿色荧光。在药物刺激下，当线粒体受损时，探针分子会迁移到溶酶体中，导致红色荧光显著减弱；相反，溶酶体受损时，探针分子会迁移到线粒体中，导致绿色荧光显著减弱。因此，可以可视化线粒体和溶酶体的损伤过程。此外，该探针还能在过氧化氢和氯醛刺激下检测细胞凋亡过程中两种细胞器的功能障碍。另外，Mi-Ly-1 还可用于测量新鲜果汁的 pH 值，并作为便携式工具监测海鲜和肉类的 pH 变化。

材料与试剂

所有用于合成的试剂（2-甲基苯并噻唑、碘乙烷、1-碘丁烷、1-碘己烷、1-碘十二烷和丁香醛）及溶剂（纯度 ≥95% 至 ≥99%）均为分析级产品，无需进一步纯化即可使用。各种分析试剂均购自上海实验试剂有限公司（中国上海）。所有溶液样品均通过溶解在水（≥18.2 MΩ·cm）或 DMSO 中制备。¹H NMR 和 ¹³C NMR 光谱是在 AVANCE III HD-600 MHz 核磁共振仪上记录的

探针的分子设计、合成及初步筛选

为了实现基于 pH 响应的线粒体和溶酶体损伤的双重检测以及细胞器迁移，我们设计并合成了一系列四种荧光探针（Mi-Ly-1 至 Mi-Ly-4）。分子设计基于以下原理（方案 1）：(1) 结合苯并噻唑盐作为线粒体靶向基团；(2) 与丁香醛衍生物单元结合，该单元既作为 pH 响应开关，又作为荧光调节剂；(3) 进行转化

结论

总结来说，我们基于丁香醛和苯并噻唑盐构建了四种荧光探针，这些探针表现出优异的光稳定性与选择性。其中，Mi-Ly-1 在双色发光模式下成功实现了对线粒体和溶酶体损伤的可视化区分。在细胞中，Mi-Ly-1 在线粒体中发出红色荧光（605 nm），在溶酶体中发出绿色荧光（560 nm），高皮尔逊共定位系数（与 MitoTracker 的共定位系数为 0.84）证实了其精确的靶向性

CRediT 作者贡献声明

黄永飞：撰写初稿、获取资金、进行正式分析。高子凡：数据整理。范哲峰：撰写与编辑。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（编号：22407083）、山西基础研究计划青年项目（编号：202203021222221）、山西师范大学自然科学基金（编号：JCYJ2023018）以及山西师范大学分析检测中心的财政支持。