《Molecules and Cells》：The expanding roles of adhesion GPCRs in neural circuit assembly
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本综述系统阐述了黏附GPCR（aGPCR）家族通过结合跨突触黏附与GPCR信号传导，在调控突触形成和神经环路组装中的新兴机制。重点聚焦Latrophilins（ADGRL）、CELSRs（ADGRC）和BAIs（ADGRB）亚家族，揭示了其在海马、小脑等特定神经环路中介导突触特异性的分子基础，并深入探讨了aGPCR功能异常与ADHD、癫痫、自闭症等神经发育障碍的关联，为理解神经连接编码及开发靶向疗法提供了新视角。
黏附GPCR在神经环路组装中的扩展作用
引言
哺乳动物大脑由数以亿计的神经元组成，这些神经元通过数万亿的突触连接形成复杂的神经环路。正确建立突触连接对于神经系统功能至关重要，它使我们能够与环境互动、处理信息。尽管其重要性不言而喻，但如此复杂突触网络的生成机制仍知之甚少。Roger Sperry博士在20世纪50年代提出的“化学亲和性假说”认为，分子密码决定了靶标识别和环路连接。近年来的证据支持这一假说，表明由细胞黏附分子、分泌因子和细胞表面受体等胞外蛋白组成的组合密码是神经环路形成的核心组成部分。然而，与这些不同密码相对应的特定细胞内信号图谱仍未得到充分研究。某些胞外密码可能激活指导共享突触组装通路（如活性区）的信号通路，而其他组合密码则可能激活介导多样性和突触特异性的非重叠通路。
过去几十年的工作已经验证了组合密码控制突触特性和组装。最著名的例子是突触前神经轴蛋白（Neurexins）及其一系列的突触后配体，包括神经连接蛋白（Neuroligins）、小脑蛋白（Cerebellins）、LRRTMs和钙结合蛋白（Calsyntenins）。这些相互作用受到广泛可变剪接的精细调控，产生了塑造突触特性的突触特异性分子密码。然而，大量文献支持神经轴蛋白可能不参与突触组装的初始阶段，而是参与突触的功能成熟和可塑性。相反，最近的研究表明，黏附GPCR（aGPCR）的几个亚家族以同时需要胞外黏附和胞内信号传导的方式，对突触形成和神经环路组装至关重要。
黏附GPCR概述
aGPCR是五大GPCR家族之一，在人类中有33个成员，分为9个亚家族。aGPCR具有三个共同特征：一个由多个黏附结构域组成的广泛N端胞外区、一个aGPCR特征性的GAIN结构域，以及随后的7次跨膜GPCR结构。此外，大多数aGPCR拥有一个大的胞内C末端尾部，可能作为蛋白质相互作用的枢纽。在这些特征中，GAIN是一个进化上保守的结构域，因其在aGPCR信号传导中的作用而受到关注。许多aGPCR的GAIN结构域包含一个自蛋白水解切割位点，可产生一个栓系激动剂（Stachel peptide）。涉及分子内TA依赖性信号传导的两种模型已被探索。在解离模型中，黏附力可能移除N端片段（NTF），暴露TA使其能够与aGPCR的正交位点结合从而激活信号传导。相反，非解离模型认为，自蛋白水解切割和/或NTF移除对于通过TA进行信号传导是不必要的。aGPCR也可以使用其他TA非依赖性机制，包括胞外NTF和7TM之间的构象耦合，将黏附信息传递至GPCR以控制信号传导。
Latrophilins
Latrophilin（Lphn）于1996年被发现，是黑寡妇蜘蛛毒液中一种强效神经毒素α-拉托毒素的受体，该毒素能引起大量神经递质释放。随后的实验鉴定出Lphn是一种在脊椎动物和无脊椎动物之间进化保守的aGPCR，表明它们可能在整个系统发育过程中扮演关键的生物学功能。最初，Lphn被认为是一种突触前受体，因为α-拉托毒素能有效触发突触前神经递质释放。然而，进一步的研究表明Lphn定位于突触后。哺乳动物主要有三个旁系同源物（Lphn1、Lphn2和Lphn3），每个都含有一个PDZ结合基序，可与突触后支架蛋白SHANK结合。SHANK是重要的突触后支架，对于突触后受体、通道和信号酶的突触定位至关重要。此外，Lphn的胞内尾部已被证明能够特异性相分离突触后支架，这表明将液-液相分离的突触支架招募到新生突触是Lphn在突触组装中功能的关键组成部分。
每个Lphn旁系同源物都由特征性的胞外N端区域、GAIN结构域、7TM和C端尾部组成。N端包含GAIN结构域上游的三个独特结构：一个激素结合区（HBR）以及嗅觉介导素和凝集素黏附结构域。嗅觉介导素和凝集素结构域与几种突触前配体结合，包括突触前teneurins。Teneurins是大的II型跨膜蛋白，包含4个哺乳动物旁系同源物，每个都能以高亲和力与凝集素结构域结合。第二个主要的突触前配体是纤连蛋白富亮氨酸跨膜蛋白（FLRTs），它有三个哺乳动物旁系同源物（FLRT1-3）。与teneurin相反，FLRTs以高亲和力与嗅觉介导素结构域结合。最后，已知神经轴蛋白（Neurexin）也能在嗅觉介导素结构域与Lphn1形成跨细胞复合物，尽管这种相互作用是目前三种主要跨细胞配体中最不明确的。考虑到FLRTs也结合嗅觉介导素结构域，Neurexin和FLRTs可能会竞争Lphn结合，从而多样化可能的黏附组合。
最近的研究表明这些相互作用在神经环路形成和突触特异性中起着关键作用。在小鼠海马中，Lphn2作为突触后靶标识别受体，用于识别内嗅皮层轴突投射到CA1锥体神经元的 stratum lacunosum-moleculare 层。在此，Lphn2缺失导致来自这些输入的兴奋性突触和树突棘密度减少约50%，而抑制性突触没有改变。相反，突触后Lphn3选择性定位于CA1锥体神经元的 stratum oriens 和 stratum radiatum，作为在非重叠、互补的树突CA1亚区中的另一个识别受体。这些区域接收来自CA3谢弗侧支的输入，这是与进入 stratum lacunosum-moleculare 的内嗅皮层输入不同的通路。与Lphn2类似，CA1神经元中的Lphn3缺失导致兴奋性突触密度减少约50%，而抑制性突触没有观察到变化。因此，黏附受体Lphn2和Lphn3分别选择性指导穿通通路和谢弗侧支通路突触在海马CA1神经元上的形成。这些发现表明，突触后aGPCR Lphn2/3在同一神经元中共表达，但通过不同的黏附相互作用或不同的C端尾部相互作用定位于不同的树突亚区。这些突触后受体然后指导不同的突触前输入到它们各自的亚区形成突触。相比之下，突触后Lphn1对海马细胞的胞体周围抑制性突触至关重要，这表明其功能与Lphn2/3不同。
从机制上讲，Lphn3依赖的突触特异性需要teneurins与凝集素结构域的结合以及FLRTs与嗅觉介导素结构域的结合，因为这两种配体的结合作为一种协同检测机制。虽然所有Lphn在体外都能结合Teneurins和FLRTs，但Lphn1和Lphn2的突触功能是否需要同时结合这两个伙伴仍有待探索。此外，考虑到Lphn1-3的不同作用，它们可能在体内与特定的Teneurin和FLRT旁系同源物组合相互作用。未来的研究需要检验这些可能性。在细胞内，Lphn3在突触组装中的作用也需要GPCR信号传导。Lphn已被证明能激活一系列G蛋白（如Gαs/cAMP, Gα12/13）。其中一些G蛋白通路，包括Gαs/cAMP，在兴奋性突触形成中已有明确作用，而其他如Gα12/13，则对抑制性环路组装很重要。除了细胞内信号传导，预突触和后突触机制的液-液相分离也参与了Lphn-teneurin的功能。Teneurin的胞内结构域特异性相分离突触前活性区成分，而Lphn特异性招募突触后相分离凝聚物，从而能够重建一个基本的突触连接。这些发现支持了teneurin-Lphn复合物在突触组装过程中将预突触和后突触的液-液相分离支架招募到新生突触。因此，Lphn3协调跨突触黏附与突触后GPCR信号传导和支架招募，以控制兴奋性突触组装，但这些数据仍需在Lphn1/2以及其他脑区中进行验证。此外，需要更多的工作来研究Lphn在突触稳定和消除中的作用。总的来说，Lphn协调了一个精细的跨突触复合物，该复合物也由teneurins、FLRTs以及可能其他分子（如Unc5d、Neurexins）组成，形成一个跨突触的信号传导和支架装置，组织兴奋性突触的组装和特异性。
CELSRs
CELSRs/ADGRC（无脊椎动物flamingo/cFMI-1/starry night）aGPCRs，与Lphns一样，从无脊椎动物到脊椎动物高度保守，并在神经环路建立中发挥作用。哺乳动物CELSRs（CELSR1-3）显示出一个大的胞外区域，包含9个钙黏蛋白重复序列，其后是EGF样重复序列、层粘连蛋白G样和层粘连蛋白EGF样结构域、FBox、一个激素结合区和GAIN。CELSR1和CELSR3的GAIN缺乏自蛋白水解和TA依赖性激活。此外，结构研究发现第9个钙黏蛋白重复序列与GAIN形成一个界面，构成一个紧凑的模块来调节细胞黏附。CELSR的胞外区域由总共23个结构域组成，这些大型aGPCR中的高阶结构可能对于协调黏附和信号传导至关重要。
哺乳动物和无脊椎动物的CELSR旁系同源物在轴突生长和环路发育中扮演相似的角色。无脊椎动物“Flamingo”（FMI-1）主要与秀丽线虫和果蝇的轴突导向和突触发生相关。FMI-1突变体表现出果蝇视觉系统拓扑图的严重破坏，表明其在发育过程中的神经元靶标选择中起作用。此外，果蝇中的Flamingo通过Netrin/Frazzled吸引系统介导连合轴突导向，调节突触发生，并维持神经肌肉接头处的轴突健康。进一步的研究发现Flamingo指导生长锥在正确的突触后伙伴之间做出选择，支持其在神经环路建立中的功能。在秀丽线虫中，FMI-1在轴突导向中扮演类似角色，以左右不对称的方式调节轴突投射。cFMI-1突变体显示GABA能运动神经元轴突路径寻找缺陷、突触密度降低以及突触小泡在非突触区域的积累。
在哺乳动物CELSR1-3中，CELSR1在突触功能中的重要性似乎最小，因为它主要在上皮皮肤层和毛囊发育过程中建立上皮平面细胞极性。然而，研究也发现CELSR1对于胚胎发育过程中面部鳃运动神经元的迁移很重要。相比之下，CELSR2和CELSR3可能通过钙黏蛋白结构域介导的同嗜性相互作用参与神经环路发育和树突arborization。具体来说，大鼠神经元培养物中的RNA干扰实验表明，敲低CELSR2极大地减少了皮层锥体神经元和小脑浦肯野细胞中的树突arborization。相反，RNAi介导的CELSR3敲低增加了树突arborization，表现为更高水平的基底树突和更大的分支复杂性。CELSR3基因缺失研究发现其对轴突投射到前连合、皮层下靶点和内囊至关重要。CELSR3也被证明可以调节小鼠的谷氨酸能突触密度。此外，虽然潜在的同嗜性相互作用可能导致CELSR在突触前和突触后定位，但CELSRs的精确突触定位尚未明确表征。
越来越多的文献发现CELSR1和CELSR3错义突变与癫痫发作和癫痫相关，支持CELSR功能改变导致神经系统疾病的观点。总的来说，证据支持CELSRs是环路组装中重要的黏附和信号分子。虽然CELSR钙黏蛋白可能参与同嗜性相互作用，但大的胞外区域可能为目前未知的多种蛋白质-蛋白质相互作用产生界面。
BAIs
BAI1-3/ADGRB1-3 aGPCRs包含一个胞外区域，具有N端结构域、血小板反应蛋白1型重复序列（TSRs）、一个激素结合区、GAIN结构域、7TM以及一个带有PDZ结合基序的胞内尾部。BAI1定位于突触后密度，BAI1缺失改变了CA1锥体神经元的突触后超微结构并导致学习缺陷。类似地，BAI2和BAI3在突触后区室中富集，并且对兴奋性突触和树突棘密度也很重要。因此，与Lphn2/3类似，BAIs是对于兴奋性突触形成重要的突触后aGPCRs。
BAI3在神经环路组装中的作用受其与分泌性C1ql蛋白相互作用的调节。在发育过程中，小脑浦肯野细胞上的一部分攀爬纤维连接被维持，而其余部分被消除。C1ql1是一个关键的顺行信号，通过与其在浦肯野细胞上的突触后受体BAI3相互作用来控制“单一胜出”的攀爬纤维连接。此外，RTN4受体作为BAIs的高亲和力配体，这种方式需要特定的糖基化模式。这种相互作用对于神经突发育和突触形成至关重要。此外，这一发现提出了利用不同糖基化模式作为产生突触特异性多样性的额外机制的前提。与Lphns类似，突触后BAI aGPCRs整合多种胞外相互作用以介导兴奋性突触形成。鉴于BAI缺失导致兴奋性突触的部分丧失，类似于Lphn2/3，BAIs和Lphns是否定位于并对相同或不同的突触群体重要尚不清楚。
其他aGPCRs
其他几个aGPCR家族不仅对神经环路组装重要，而且对神经发育的其他关键方面也很重要。一个增长的领域是aGPCR在胶质细胞中的功能。例如，ADGRG1对于几种生物体中的少突胶质细胞发育和髓鞘形成至关重要。此外，ADGRV1有助于听觉系统中的髓鞘形成。几个aGPCRs对于周围神经系统髓鞘形成很重要，包括ADGRG1和ADGRG6。ADGRG1在小胶质细胞中也具有重要作用，通过MYC转录因子调节突触消除从而调控环路。许多aGPCRs在非神经元细胞中表达，并且可能在这些细胞类型中具有目前尚未识别的塑造神经环路的功能。
aGPCRs与神经系统疾病
Lphn功能障碍与各种神经系统疾病相关，包括注意缺陷多动障碍（ADHD）、自闭症谱系障碍和物质使用障碍。在这些疾病中，越来越多的研究将Lphn3与ADHD联系起来。Lphn3缺陷在几种模式生物中产生多动并改变运动行为。在果蝇中，唯一Lphn同源物dCirl的突变导致异常的运动活动，包括明显的爬行模式和更少的活动距离。此外，条件性dCirl敲低诱导多动和果蝇夜间平均睡眠时间减少，这两者都是ADHD样表型的指标。在斑马鱼中，Lphn3.1敲低导致游泳距离增加和普遍多动。这种关系在啮齿类动物中也可见，Lphn3功能丧失研究导致多动表型，初步证据暗示纹状体环路的改变。最后，大量遗传学研究将Lphn3基因与人类ADHD的病因学联系起来。其中一些错义突变损害G蛋白激活。尽管证据不断增长，但Lphn3在疾病中的突触特异性和机制基础仍然未知。最近的研究也将Lphn2变异与可卡因使用障碍联系起来，尽管这些联系需要更多研究。
最近一系列人类遗传学研究鉴定出与热性惊厥和癫痫相关的CELSR1-3变异。一个位于7TM GPCR的胞内环3（ICL3）的CELSR3错义突变（该区域对G蛋白偶联至关重要）以及两个位于胞外区域的不同突变表明，CELSR黏附和/或信号传导的破坏可能改变突触生理并增加癫痫发作的易感性。ADGRV1突变也与癫痫相关，小鼠模型表现出对听源性癫痫发作的倾向性增加。尽管支持aGPCR功能障碍在疾病中的证据不断增长，但目前尚无批准靶向aGPCR的疗法。考虑到GPCR是FDA批准的最大药物靶点类别，这一点令人惊讶。目前，aGPCR由于其自身特点难以用传统小分子方法靶向，并且我们对各种aGPCR如何导致精神疾病的机制理解尚不充分。因此，需要对aGPCR信号传导机制以及不同的药物靶向策略进行更多研究，以开发针对aGPCR和疾病的新疗法。
结论与展望
负责aGPCR功能的潜在分子机制尚未完全明了。虽然aGPCR拥有各种结合跨突触配体的N端黏附结构域，但尚不清楚这些配体的不同组合如何影响信号传导和/或信号偏向，以及黏附与TA依赖性或非依赖性激活之间的相互作用。由aGPCR激活触发的精确下游突触信号级联反应也是个谜，研究这些信号通路是理解aGPCR功能的关键下一步。aGPCR信号传导的时间方面也研究不足。由于aGPCR与突触组装有关，了解aGPCR在关键时间点激活的时机如何影响突触成熟非常重要。最后，尚不清楚突触aGPCR如何促进突触纳米组织。例如，aGPCR可能在突触处组织成纳米柱或参与组装纳米柱。未来的工作需要确定某些aGPCR是否参与纳米级别的突触特异性组织。
除了aGPCR功能外，需要更多工作来研究如何将aGPCR作为新治疗靶点。aGPCR呈现独特但具有挑战性的药物靶点，原因包括不同aGPCR之间TA正交位点的相似性。这可能使小分子缺乏特异性，使得直接靶向这些位点变得困难。此外，许多aGPCR是孤儿受体或尚未得到充分研究，使得治疗开发更加困难。在所讨论的aGPCR中，Lphn3与ADHD和兴奋剂反应有强烈且日益增长的联系。多种模式生物在Lphn3缺失后表现出多动和运动改变，人类遗传研究已将Lphn3与ADHD病因学联系起来。此外，Lphn3的黏附相互作用和信号传导相对研究较多，使得Lphn3成为未来治疗开发的有希望靶点。
总的来说，越来越多的证据支持aGPCR整合胞外相互作用与GPCR信号传导，以控制突触形成和神经环路组装的关键方面。对aGPCR功能和信号传导的更深入理解将为神经环路如何通过突触连接建立和组织提供机制性见解。
