靶向N-Myc/Aurora-A蛋白相互作用的共价肽类抑制剂：磺酰氟弹头的设计与应用

《Journal of Peptide Science》：Covalent Peptide-Based N-Myc/Aurora-A Inhibitors Bearing Sulfonyl Fluoride Warheads

本综述系统阐述了基于N-Myc肽段的共价抑制剂通过引入磺酰氟（Sulfonyl Fluoride）弹头，实现靶向Aurora-A激酶的高选择性共价标记。研究证实该策略可有效阻断N-Myc/Aurora-A蛋白-蛋白相互作用（PPI），为神经母细胞瘤（Neuroblastoma）的治疗提供了新思路。文中通过荧光偏振（FA）实验和质谱分析验证了抑制剂结合效率与共价修饰特异性，为共价肽模拟物在PPI抑制剂领域的应用拓展了方法论支持。

　　

引言

靶向共价抑制剂（TCIs）在化学生物学和药物研发领域经历显著复兴。传统共价药物如青霉素的作用机制多属偶然发现，而理性设计的TCIs长期受脱靶反应性担忧的困扰。共价抑制剂理论上较非共价抑制剂具备作用强度高、作用持续时间长等优势，近年来通过新型亲电弹头设计和可靶向蛋白质组的扩展，推动了共价抑制剂的研发新浪潮。当前TCIs研发主要集中在半胱氨酸反应性探针，其中丙烯酰胺衍生物兼具理想反应性和生物相容性。然而，共价蛋白-蛋白相互作用（PPI）抑制剂和共价肽模拟物的发展相对滞后，这为相关研究提供了广阔空间。

Aurora-A作为一种有丝分裂激酶，是抗癌药物研发的潜在靶点。尽管已存在强效选择性ATP竞争性激酶抑制剂，但因其在正常生物学功能中的关键作用，尚无相关抑制剂获批临床。N-Myc与儿童癌症神经母细胞瘤密切相关。Aurora-A与N-Myc结合后可稳定N-Myc免于降解，因此破坏二者相互作用成为治疗神经母细胞瘤的潜在策略。现有策略包括变构抑制和PROTACs降解Aurora-A，而正构抑制N-Myc/Aurora-A可能在不影响Aurora-A催化功能的前提下展现优势。前期研究发现，通过合理引入约束可提升肽模拟物效力，但效能仍停留在微摩尔级别，有待优化。

材料与方法

肽合成与纯化

采用固相肽合成（SPPS）技术制备N-Myc_73–89和N-Myc_74–89系列肽段。通过手动与自动化微波辅助合成相结合，依次进行树脂溶胀、Fmoc脱保护、氨基酸偶联及凯撒测试验证。关键步骤包括：N末端乙酰化、荧光标记物FAM通过Ahx连接子偶联、以及磺酰氟弹头的引入。其中，乙烯基磺酰氟（ESF）和芳基磺酰氟（ASF）分别通过^on-resin偶联实现肽段修饰。最终肽段通过制备型高效液相色谱（HPLC）纯化，并经高分辨质谱（HRMS）验证纯度。

生物物理与生化实验

通过优化荧光偏振（FA）实验分析肽段与Aurora-A的结合特性。直接结合实验将Aurora-A_{119-403, C290A/C393A}（简称Aurora-A）与荧光标记肽共孵育，测定解离常数（K_d）；竞争实验则通过未标记肽竞争性抑制荧光示踪肽结合，计算半抑制浓度（IC₅₀）。质谱分析用于验证共价修饰：将肽段与Aurora-A共孵育后，通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）监测蛋白-肽加合物形成，并利用动力学分析计算共价修饰效率参数（k_inact、K_I）。

蛋白质酶解与位点鉴定

Aurora-A与肽段反应后，经丙酮沉淀、还原烷基化、Trypsin/Lys-C酶切，所得肽段通过纳米液相色谱-离子淌度-质谱（nanoLC-TIMS-MS）分析。利用MaxQuant软件进行可变修饰搜索和交联搜索，以鉴定共价修饰位点。

结果与讨论

共价抑制剂设计思路

基于N-Myc/Aurora-A复合物晶体结构（PDB: 5G1X），Glu73^N-Myc与Lys143^AurA之间形成盐桥，是相互作用关键位点。尽管PPI界面无半胱氨酸，但邻近存在多个亲核残基（如Lys、His、Ser/Thr）。磺酰氟作为“硬”亲电体，可修饰赖氨酸等残基，且其反应性受局部微环境和非共价亲和力调控。本研究通过在N-Myc肽段N末端引入ASF弹头，靶向Lys143^AurA，实现共价抑制。

肽段合成与活性评价

成功合成含ASF的N-Myc_{73–89 ASF}和N-Myc_{74–89 ASF}肽段，其中ESF衍生物因水溶液稳定性差未能纯化。FA竞争实验显示，N-Myc_{73–89 ASF}抑制活性（IC₅₀= 33 ± 2 μM）显著优于其母肽（IC₅₀= 179 ± 19 μM），表明ASF弹头与Glu73^N-Myc保留可协同增强结合；而缺失Glu73的N-Myc_{74–89 ASF}活性较低（IC₅₀= 118 ± 9 μM）。共价修饰Aurora-A后，荧光示踪肽结合能力大幅下降（K_d> 250 μM），证实共价修饰阻断结合界面。

选择性共价标记验证

质谱分析显示，N-Myc_{73–89 ASF}可特异性修饰Aurora-A（分子量增加~2194 Da），并观察到双修饰产物。对比其他蛋白（ADM22、hDM2、BCL-x_L、GFP-HIF-1α_L792A、MCL-1），修饰程度显著较低，表明反应为识别导向。动力学参数测定揭示，N-Myc_{73–89 ASF}的k_inact/K_I值为1.6 ± 0.2 M^?1·s^?1，呈现亲和力驱动修饰；而N-Myc_{74–89 ASF}虽修饰速率更快（k_inact/K_I= 3.5 ± 1.2 M^?1·s^?1），但其线性浓度-速率关系提示非特异性反应主导。

修饰位点鉴定挑战

尽管通过蛋白酶切-质谱联用尝试定位修饰位点，但因修饰肽段疏水性强、碎片离子鉴定困难，未能明确具体残基。手动解析提示酪氨酸残基可能参与，但需进一步验证。

结论

本研究成功开发了携带磺酰氟弹头的N-Myc肽模拟物，可实现Aurora-A的选择性共价标记与PPI抑制。尽管修饰位点未明确，且整体效能较低（受限于亲和力与反应性），但工作证实了共价肽模拟物在靶向蛋白相互作用中的可行性。后续研究需通过系统优化弹头位置、连接链及亲电基团类型，提升抑制效率，推动共价PPI抑制剂领域发展。

作者贡献与致谢

A.J.W.主导研究设计，R.S.D.和D.G.完成实验，G.W.P.负责修饰位点分析。研究受英国生物技术与生物科学研究委员会（BBSRC）及工程与物理科学研究委员会（EPSRC）资助，无利益冲突声明。