基于CymR/CuO系统的巴斯德毕赤酵母新型库马特诱导型启动子Pgc的开发与应用研究

《Microbial Biotechnology》：Development and Application of a Cumate-Inducible Promoter, Pgc, in Komagataella pastoris

本文系统报道了在巴斯德毕赤酵母（Komagataella pastoris）中构建新型库马特（cumate）诱导型启动子Pgc的创新工作。通过优化强启动子PGCW14中CuO操作子插入位点获得高活性变体PGCWCuO03，并利用截短型启动子PGAP200精细调控阻遏蛋白CymR表达，最终成功构建具有11倍诱导倍数的严谨调控系统。该研究为毕赤酵母合成生物学和代谢工程提供了安全经济的新型调控工具。

　　

1 引言

巴斯德毕赤酵母（Komagataella pastoris）作为重要的微生物细胞工厂，已成功表达超过4000种异源蛋白。随着合成生物学和代谢工程的发展，该酵母正被广泛应用于高价值生物活性化合物的合成。基因设计过程中，需要利用诱导型启动子等分子工具实现基因表达的精确时空调控，以最大化产物产量并提高过程效率。

启动子是控制基因表达强度和时序的核心遗传元件。在毕赤酵母中，甲醇诱导型启动子P_AOX1虽具有强转录活性和严谨调控特性，但甲醇的易燃性和毒性限制了其工业应用。其他诱导系统如鼠李糖诱导型启动子P_LRA3则因诱导剂成本高昂而难以大规模应用。

来自恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）F1的CymR/CuO系统由阻遏蛋白CymR和操作子序列CuO（5′-AACAAACAGACAATCTGGTCTGTTTGTA-3′）组成。当库马特（4-异丙基苯甲酸）与CymR结合后，CymR发生构象变化并从CuO解离，从而启动基因表达。该系统已在多种宿主中成功应用，但在酵母尤其是毕赤酵母中尚未见报道。鉴于库马特具有无毒、廉价且不受葡萄糖或甘油抑制等优点，成为大规模生物过程的理想诱导剂。

2 实验方法

2.1 菌株与培养基

使用大肠杆菌（Escherichia coli）Top10菌株进行DNA克隆和质粒增殖，毕赤酵母GS115作为基因克隆和库马特诱导型启动子功能表征的宿主。毕赤酵母培养使用YPD培养基和MD培养基，根据需要添加库马特。

2.2 质粒构建

从质粒pEC-XK99E扩增卡那霉素抗性盒（KanR）和质粒复制子，从基因组DNA克隆用于整合到毕赤酵母染色体gas1位点的左右同源臂。使用无缝克隆试剂盒组装最终质粒pPICG01。

将CuO插入P_GCW14的不同位点后连接T_act1终止子，构建pPICCuO系列质粒。同时，将全长或截短的P_GAP与密码子优化的cymR基因（两端包含核定位信号）及T_cyc1终止子融合形成CymR表达盒，插入pPICCuO生成最终质粒pPICCymR。

2.3 相对荧光强度测定

将绿色荧光蛋白（GFP）基因连接至上述质粒的PmeI位点，重组质粒通过电转化导入毕赤酵母。在含或不含库马特的MD培养基中培养转化子，使用酶标仪测定GFP荧光强度和OD₆₀₀，以GFP荧光强度与OD₆₀₀的比值表示相对荧光强度。

2.4 启动子替换菌株的生长特性

将PAS_chr2-1_0670基因的天然启动子替换为P_gc，通过PCR验证重组菌株GS115C，并在含或不含库马特的固体和液体培养基中评估生长表型差异。

3 结果

3.1 库马特诱导系统示意图

为在毕赤酵母中开发强库马特诱导型启动子，在强组成型启动子P_GCW14的不同位点插入CuO。将修饰后的启动子克隆到整合质粒中，靶向整合到毕赤酵母基因组gas1位点，构建pPICCuO系列质粒。GFP基因受这些工程化启动子调控，通过测量相对GFP荧光强度评估转录活性。

为评估CymR/CuO系统功能，将P_GAP驱动CymR表达的盒导入pPICCuO质粒，构建pPICCymR质粒。通过构建和筛选P_GAP截短变体优化CymR表达，成功实现了严谨可调的库马特诱导基因表达系统。

3.2 库马特对毕赤酵母生长的影响

评估库马特对毕赤酵母生长的抑制效应发现，25 mg/L库马特仅引起轻度生长抑制，生物量产量降至对照的78%。50 mg/L时出现显著抑制效应，100 mg/L时完全抑制生长。因此选择25 mg/L作为后续实验浓度，在有效诱导基因表达的同时最小化对细胞生长的不利影响。

3.3 CuO插入对P_GCW14活性的影响

在P_GCW14的关键转录调控元件（TATA盒和CAAT盒）附近插入CuO。结果表明，在位点A或B插入CuO使GFP荧光强度降低约80%，位点C插入导致荧光表达几乎完全丧失，而位点D插入后荧光强度与原始启动子相当，转录活性基本保留。因此确定位点D为CuO整合的最佳位置，将由此获得的启动子命名为P_GCWCuO01。

3.4 CymR表达强度对P_GCWCuO01诱导性的影响

通过截短P_GAP启动子精细调控CymR表达水平。当P_GAP截短至50 bp时，无论有无诱导剂均观察到强绿色荧光，表明缩短的启动子转录活性低，无法驱动高CymR表达。当P_GAP截短至200 bp时，未诱导状态下检测到弱荧光，诱导后绿色荧光强度增加约9倍，表明CymR表达水平适中。使用全长P_GAP调控CymR表达时，即使诱导后也只观察到弱绿色荧光信号。因此选择P_GAP200调控CymR表达，构建库马特诱导型启动子P_gcc01。

3.5 含双拷贝CuO的P_GCW14特性

为减少P_GCWCuO01的渗漏表达，在P_GCWCuO01的另一位点（B或E）引入第二个CuO，构建启动子P_GCWCuO02和P_GCWCuO03。转录活性分析显示，P_GCWCuO02（位点B和D插入CuO）的转录活性比P_GCWCuO01降低约70%，而P_GCWCuO03（位点D和E插入CuO）仅降低约30%。因此选择P_GCWCuO03进行进一步验证。

3.6 库马特诱导型启动子P_gc的特性

基于P_GCWCuO03和由P_GAP200调控的CymR表达单元，开发新型库马特诱导型启动子P_gc。

对三种启动子（亲本启动子P_GCW14、P_gcc01和P_gc）的性能表征表明，P_GCW14的转录活性在有无库马特时无显著变化。P_gcc01对诱导响应强烈，GFP荧光从9000增加至86000，诱导倍数约8.6倍。P_gc的诱导性优于P_gcc01，GFP荧光从8000增加至110000，诱导倍数近13倍。值得注意的是，P_gcc01和P_gc均表现出高于P_GCW14的转录活性，这可能与CymR表达单元引入启动子上游后序列介导的相互作用有关。P_gc相比P_gcc01诱导强度提高约28%，基础渗漏降低约11%。

3.7 基于P_gc的毕赤酵母工程化

将PAS_chr2-1_0670基因的天然启动子替换为P_gc，构建工程菌株GS115C。理论上，无库马特诱导时，GS115C中PAS_chr2-1_0670的转录水平应低于原始水平，导致生长速率降低；诱导后表达增强，恢复生长。实验结果与预测一致：GS115C在无库马特的YPD培养基上形成较小菌落，而在含库马特的培养基上形成较大菌落。液体培养实验进一步证实，诱导条件下GS115C的生物量积累显著高于非诱导条件，成功实现了PAS_chr2-1_0670表达的P_gc调控。

4 讨论

启动子是控制基因表达时序、位置和强度的基本元件，诱导型启动子因其精确控制表达动态的能力在生物技术中具有特殊价值。毕赤酵母中已建立多种诱导型启动子，但这些系统常受碳分解代谢物抑制，且诱导剂的特性限制了其实用性。

本研究选择CymR/CuO系统在毕赤酵母中实施，基于库马特的安全性和经济性优势。选择强组成型启动子P_GCW14作为骨架，通过优化CuO插入位点获得高性能变体P_GCWCuO03。通过系统调控CymR表达水平，实现了高诱导比率的严谨调控。该系统的一个缺点是存在可检测的基础表达，未来可通过增加CuO拷贝数等策略进一步提高调控严谨性。

P_gc为毕赤酵母合成生物学和代谢工程提供了强大而多功能的工具。通过替换PAS_chr2-1_0670基因天然启动子的成功实践，展示了该启动子在微生物底盘工程和功能基因组学中的应用潜力，为先进生物制造和合成生物学应用提供了有力的调控策略。