RPS6A可调磷酸化调控拟南芥幼苗光形态建成的分子机制

《Plant, Cell & Environment》：Fully Tunable Phosphorylation of RPS6A Ensures the Successful Development of Arabidopsis Seedlings

本研究系统揭示了拟南芥核糖体蛋白S6A（RPS6A）C端丝氨酸残基（S229/S231/S237/S240）作为"种子位点"通过级联磷酸化调控光信号转导的新机制。作者创新性地构建了系列磷酸化模拟（D）和磷酸化缺失（A）突变体，证明RPS6A的完全可调磷酸化对幼苗暗形态建成（ hypocotyl elongation）和光形态建成（cotyledon opening）不可或缺，其动态磷酸化水平直接调控光合蛋白（LHCB1）积累和翻译效率（polysome profiling）。该研究为阐明植物光信号调控翻译的分子通路提供了关键证据。

　　

研究背景与科学问题

真核生物核糖体由40S小亚基和60S大亚基构成，包含4种rRNA和79-80种核糖体蛋白。核糖体蛋白S6（RPS6）作为小亚基重要组分，其C端多位点磷酸化在哺乳动物中已被证实可响应营养、能量等生理信号，但磷酸化对翻译效率的具体调控机制长期存在争议。拟南芥幼苗的光形态建成为研究RPS6磷酸化动态提供了理想模型，黑暗生长的幼苗在光照4小时内即可触发RPS6大规模磷酸化，并显著提升编码叶绿体功能蛋白mRNA的翻译效率。

实验设计与方法创新

研究团队首先构建了FLAG标签标记的RPS6A回补株系（RPS6A-FLAG），通过表型分析证实其能完全恢复rps6a突变体的子叶张开延迟和下胚轴伸长缺陷。利用Phos-tag^?电泳技术，发现RPS6A-FLAG在光照4小时后呈现与内源RPS6A一致的磷酸化迁移条带。通过免疫共沉淀结合平行反应监测（PRM）质谱技术，首次在去黄化幼苗中鉴定出10个单磷酸化位点（S37/T69/T127/T185/S229/S231/S237/S240/S241/S247）和3个双磷酸化肽段，其中T185位点为植物RPS6中首次验证。

磷酸化级联机制解析

定量分析显示光照可抑制N端S37/T69/T127/T185磷酸化，但显著诱导C端S231/S237/S240磷酸化。通过构建系列磷酸化模拟（S→D）和磷酸化缺失（S→A）突变体，发现S231单点突变即可严重破坏级联磷酸化，而S229/S231/S237（或S240）三重突变体（AAA）与七重突变体（PN）同样完全丧失光诱导磷酸化能力。值得注意的是，磷酸化模拟突变体DD^229/231在黑暗条件下即呈现基础磷酸化，表明S229/S231构成了光信号响应的分子开关。

生理功能验证

表型分析显示仅有野生型RPS6A能完全恢复rps6a突变体的下胚轴伸长缺陷，所有单点突变体仅呈现部分功能互补。在光形态建成过程中，PM（七重磷酸化模拟）和PN（七重磷酸化缺失）株系均表现出光合系统II最大光化学效率（F_v/F_m）下降、LHCB1蛋白积累受阻以及叶绿素合成延迟。特别值得注意的是，PM株系在光照24小时后仍无法正常绿化，表现出比PN更严重的表型，提示磷酸化"锁死"状态可能通过显性负效应干扰内源RPS6B功能。

翻译效率调控机制

多糖体分析显示，光照4小时后野生型RPS6A株系的核糖体负载效率（PL%）显著提升，且RPS6A蛋白从非多糖体向多糖体区域转移。而PM和PN株系的光诱导翻译增强效应明显减弱，证明RPS6A磷酸化动态平衡是光调控翻译效率的必要条件。结构生物学证据表明，RPS6C端柔性区域暴露于核糖体表面，为 kinases/phosphatases 的可逆调控提供了结构基础。

理论突破与进化意义

该研究首次在植物中发现S229/S231/S237/S240作为级联磷酸化的"种子位点"，其调控模式虽与哺乳动物S235/S236启动的磷酸化级联类似，但磷酸化位点在绿色植物谱系中发生重排。研究结果解释了此前不同实验室关于RPS6磷酸化功能争议的原因：在稳态生长的成熟植株中，翻译调控存在代偿机制，而幼苗早期发育阶段对RPS6磷酸化动态具有绝对依赖性。这项工作为阐明光信号通过核糖体蛋白磷酸化精确调控翻译的分子通路提供了关键证据，对理解植物适应自然光环境变化的进化策略具有重要启示。