《Nature Genetics》：Transient histone deacetylase inhibition induces cellular memory of gene expression and 3D genome folding
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本研究发现，短暂抑制组蛋白去乙酰化酶（HDAC）可诱导小鼠胚胎干细胞（mESCs）产生基因表达和三维（3D）基因组折叠的细胞记忆。通过RNA测序（RNA-seq）、染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）和超深Micro-C分析，揭示了组蛋白修饰（如H3K27ac、H3K4me1）与染色质构象（如A/B区室、染色质环）的动态互作。关键发现包括：HDAC抑制剂（如TSA）扰动后，部分基因表达和3D结构变化在扰动解除后仍持续存在，且Polycomb介导的染色质拓扑（如PRC1环）在维持基因抑制记忆中有核心作用。这为理解表观遗传记忆和细胞适应性提供了新视角。
HDAC抑制改变表观基因组和转录组
为了破坏小鼠胚胎干细胞（mESCs）的染色质状态平衡，研究团队用组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂曲古抑菌素A（TSA）对细胞进行4小时的脉冲处理。通过优化条件，使组蛋白超乙酰化被强烈诱导，而乙酰化组和细胞周期进程的影响最小。校准的染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）显示，急性TSA处理诱导了全基因组范围的H3K27超乙酰化，发生在顺式调控元件、基因体和基因间区域。通过将基因组区间分类为活跃（富含H3K27ac、H3K4me1或H3K4me3）和抑制（富含H3K9me3、H3K27me3或H2AK119ub）状态，发现TSA处理导致更大比例的基因组处于活跃状态。差异ChIP-seq峰的基因注释指向发育过程的放大和多能性的抑制。
批量RNA测序（RNA-seq）分析显示，HDAC抑制对转录组的影响与组蛋白景观的变化相吻合。下调基因与干细胞群体维持相关，而上调基因与神经谱系的发育成熟相关。因此，急性HDAC抑制导致H3K27ac的广泛积累和组蛋白修饰景观的全局变化，促进与多能性退出相关的基因表达程序。
全局和局部结构变化标记TSA染色质状态
成像研究表明，TSA处理在全局和局部尺度上导致染色质解压缩。为了解这些改变如何转化为染色质接触的变化，生成了超深Micro-C图谱。数据显示，TSA处理导致反式（trans）接触显著增加，同时顺式（cis）相互作用显著减少。TSA处理还导致显著的A区室相互作用（ESCs的特征）减少，而B-B相互作用（分化细胞的特征）在顺式中变得突出。A和B区室受到TSA不对称影响，A区室中激活组蛋白标记的增益超过B区室，大多数基因表达失调对应于位于A区室的转录起始位点（TSSs）。
通过机械三维聚合物建模模拟TSA诱导的变化，发现TSA构象与A结构域比B结构域刚度增加更大兼容。刚度变化成功预测了实验中观察到的区室强度转换，而无需修改A-A和B-B吸引能。模型还预测了模拟核中A结构域的周边位移，这通过H3K27ac免疫荧光得到证实，显示TSA处理细胞中H3K27ac焦点更接近核周边。
随后表征了染色质环的变化。识别出3000多个具有差异环强度的焦点相互作用，这些相互作用与发育基因座强烈相关。虽然检测到TSA中CTCF结合增加，但CTCF介导的环整体变弱。相反，非CTCF环（携带激活或抑制染色质特征）在TSA处理后变得更强。使用核HDAC抑制剂罗米地辛进行实验，揭示了几乎相同的转录反应和3D基因组折叠的类似变化。
表观基因组和结构变化调控基因表达变化
为了解TSA诱导基因表达失调的表观基因组变化，发现上调的TSSs富含在TSA中获得信号的H3K27ac峰，而信号减少的H3K27ac峰更常见于下调的TSSs。H3K27ac的增益伴随着染色质可及性的适度增加和H3K4me1的显著增益。在一大部分上调基因中检测到重叠的H3K4me3和H3K27me3信号，暗示双价基因易受TSA介导的基因去抑制影响，而不丧失H3K27me3。
为了解转录上调是否由异位增强子激活引起，检查了获得H3K4me1的基因组区域与TSSs的线性接近度。揭示这些峰比不上调的表达匹配对照基因的启动子更接近上调的基因启动子。类似地，上调的TSSs被发现更接近先前描述的预备和 poised 增强子。由于增强子激活和随后的基因表达通常伴随着增强子-启动子（E-P）接触的增加，分析了上调TSSs处染色质环的变化。虽然检测到环与上调TSSs的线性接近度增加，但基因表达上调发生在启动子接触没有变化的情况下。
有趣的是，激活标记也在下调TSSs附近获得，而没有抑制性组蛋白修饰的积累。然而，对差异ChIP-seq峰分布的仔细检查显示，激活组蛋白标记信号减少的区域更常位于下调TSSs附近，表明表观基因组和转录组变化之间的功能耦合。发现H2AK119ub信号增加的位置在上下调TSS周围同样存在，与最近证据一致，暗示H2AK119ub在基因抑制和激活中都有作用。一部分下调TSSs被发现富含Myc和YY1结合，这些是HDAC靶点的转录调节因子，其乙酰化状态可以调节其分子功能。与上调TSSs不同，下调TSSs周围的启动子环变得更强。还注意到在一些最强下调基因周围形成了显著的新生环，存在于现有的H3K9me3位点，仅伴有H3K9me3水平的轻度增加。这些表明抑制性染色质接触可能代表与基因下调相关的广泛分子过程。
ESCs在TSA去除后恢复转录和染色质状态
然后假设如果扰动诱导了细胞记忆，染色质和基因表达变化应该在初始因果事件之后持续存在。为此，清洗TSA处理的细胞并让它们恢复24小时（大约两个细胞倍增时间）。TSA去除24小时后，蛋白质乙酰化恢复到未扰动水平，细胞世代追踪显示所有细胞在恢复期间都已分裂。TSA对组蛋白景观的影响同样容易逆转。过量的H3K27ac、H3K4me1和染色质可及性立即恢复，H3K27ac峰在TSSs周围重新富集，除了H3K9ac，定量分析显示在几个基因组位点有轻微的持续富集。与染色质标记的恢复一致，TSA诱导的转录失调几乎完全逆转，只有少数基因显示残留的失调。尽管某些基因组位点保留了略微增加的H3K27ac，但它们与保持失调的TSSs没有强烈共定位。总之，这些数据显示，组蛋白标记和基因表达在TSA去除后24小时通常恢复，但一小部分基因保持了对扰动的记忆。
为了排除近乎完全恢复是由于恢复时间不足的可能性，在TSA去除后48、72和96小时检测了基因表达变化。有趣的是，差异表达基因的数量随着恢复时间的延长而增加。相反，在更短的恢复时间（16和20小时）评估转录显示，基因表达变化在24小时时最低。关键的是，没有发现HDACs的非组蛋白靶点与持续基因表达失调之间存在任何联系。虽然不能完全排除，但这最小化了长期转录后果是由于HDAC抑制的多效性效应的可能性。
24小时恢复后，多能性网络活动被有效恢复，大多数发育过程再次下调。由于mESC培养条件主动抑制分化，询问有效恢复是多能细胞的一般特征，还是强加主导细胞状态的生长条件的结果。因此，将mESCs培养成 gastruloids，在Chiron脉冲前立即用TSA处理4小时。TSA对转录组的影响在mESCs和 gastruloids 之间强烈相关，基因本体（GO）富集分析显示两种条件下类似的发育失调。清洗后（24小时内恢复H3K27ac），让对照和TSA处理的 gastruloids 发育3天。虽然TSA处理的 gastruloids 中神经外胚层标记Sox2的阳性染色区域扩大，但转录组在很大程度上重新建立。为了增强发现 beyond 多能细胞的相关性，测试了神经祖细胞（NPCs）从TSA脉冲恢复的能力。这揭示，与ESCs类似，TSA去除24小时后转录差异很小，在48小时增加。虽然对TSA的转录反应在ESCs和NPCs中部分与类似调控通路相关，但存在细胞类型特异性差异。
总之，mESCs具有在超乙酰化脉冲后恢复其转录和组蛋白修饰景观的显著能力。在 gastruloids 和NPCs中的发现支持这些观察，即HDAC抑制对转录组的影响是深远的，但从中的转录恢复是有效的。然而，数据也表明细胞保持了对TSA脉冲的部分记忆。
基因组结构保留其过去构象的部分记忆
为了进一步探索TSA脉冲是否可以被mESCs记录，分析了恢复后的3D基因组折叠。令人惊讶的是，发现染色质构象没有完全恢复——顺式-反式比率部分恢复，顺式接触耗竭持续存在，特别是在A区室。此外，虽然A-A相互作用在反式中有效恢复并在顺式中显示一些增加，但顺式中的B-B相互作用仍然突出。同样可以在基因水平检测到基因组构象的持续变化。高分辨率特征向量分解揭示了转录和结构恢复变得解耦的局部实例。例如，TSA中F11、Klkb1和Cyp4v3基因座的基因表达上调将约200千碱基（kb）编码基因组片段切换到A区室。恢复后，基因的抑制成功恢复；然而，编码基因组片段保持A区室身份，如在TSA条件中。此外，在不完全的结构恢复在某些基因组位点可见，其中增加的环强度在整个恢复期间保持。最后，发现虽然在TSA中失去强度的差异环完全恢复，但在TSA处理后变得更强的环仍然增强。
总之，基因组结构携带其TSA诱导构象的记忆，这在顺式接触频率、区室相互作用和染色质环水平上可见。
持续基因表达变化与调控性3D接触相关
然后推理，如果持续的微小结构和转录变化标志着细胞记忆，那么重复暴露于TSA应该具有更严重的后果。因此，使mESCs经历第二个TSA处理和恢复周期。虽然第二次TSA处理的效果与第一次相当，但从第二次处理恢复较不完全。数百个基因保持强烈失调，并与发育过程相关，表明重复暴露对细胞身份有更大影响。注意到这可能部分是由于第一次TSA脉冲后随着时间延长基因表达失调增加。接下来，根据它们从任一次TSA处理恢复的能力对差异表达基因进行分层，并在双重处理过程中绘制它们的表达。虽然大多数失调基因在其天然和异位表达状态之间振荡，一个基因子集显示逐渐加重的基因表达失调，指示细胞记忆。
旨在区分恢复基因与保留其TSA诱导表达状态记忆的基因的染色质特征。首先，分析了上调TSSs周围的组蛋白乙酰化和染色质可及性。显示恢复基因和未恢复基因之间没有差异——两组都以激活染色质信号的增益为特征，在两次恢复期间有效恢复。第一次恢复后保持富集的H3K9ac峰在恢复和未恢复的TSSs周围同样富集，表明H3K9乙酰化不是记忆效应的原因。相反，发现未恢复基因处存在弥散但强大的预先存在的E-P接触，与恢复基因相比，并且未恢复基因也表现出更高的形成环的倾向。接下来，在下调基因中类似的TSS分析揭示，未恢复的基因是发育抑制因子Polycomb的靶标，如启动子周围丰富的H3K27me3信号所示。在NPCs中也发现同样的情况，表明持续的基因下调可能与多种细胞类型中的Polycomb活性相关。有趣的是，下调发生在没有明显H3K27me3变化的情况下。相反，发现Polycomb环在未恢复TSSs处获得显著强度，以及全基因组范围。关键的是，增加的Polycomb介导的环在第一次恢复期后持续存在，环锚点处H3K27me3水平没有重大变化。持续的环增强是Polycomb特有的特征，而不是一般的抑制环，因为发现新生的H3K9me3环有效恢复。
总之，重复的瞬时HDAC抑制触发基因表达的细胞记忆，这与失调TSSs周围的强大结构特征相关——对于上调基因，突出的预形成E-P接触；对于下调TSSs，加强的抑制性Polycomb环可能使改变的活动状态永久化。
PRC1介导的染色质环控制持续的基因下调
由于Polycomb靶基因的持续转录下调发生在没有PRC2沉积的H3K27me3标记积累的情况下，试图了解记忆是否依赖于PRC1复合物的活性。进行了Ring1B的校准ChIP-seq分析，显示恢复后超过8000个位点的PRC1结合增加。这些位点既没有H3K27me3也没有H2AK119ub显示持续增加，与发现Polycomb组蛋白修饰景观基本未改变一致。为了测试转录记忆是否依赖于PRC1介导的空间聚类，通过消耗典型PRC1的两个亚基（PCGF2和PCGF4）破坏了Polycomb介导的环。虽然持续的PCGF2消耗导致Polycomb靶标的轻度去抑制，但对TSA-恢复双重处理过程的转录反应在E14、Pcgf2fl/fl-OHT和Pcgf2fl/fl+OHT细胞之间高度相似。然而，PCGF2消耗使未从TSA脉冲恢复的基因数量减少了超过两倍，表明较弱的记忆反应。关键的是，大多数在-OHT条件下显示持续下调的基因在+OHT条件下没有表现出持续下调，表明Polycomb环的破坏重写了对TSA的记忆反应。然而，识别了一个较小的基因子集，在+OHT细胞中显示持续下调，这些也是Polycomb靶标。然而，虽然仅在-OHT细胞中保持下调的基因集在TSSs显示环增加，但+OHT特有的未恢复基因没有，并且+OHT TSS环锚点处Ring1B的增加发生在较小程度，表明它们的下调依赖于独立于PRC1介导的染色质环的机制。
总之，Polycomb结构域相互作用的破坏调节记忆反应，证明PRC1介导的空间聚类负责TSA诱导的Polycomb靶基因的持续下调。
讨论
表观遗传层之间的相互作用以及它们是协同还是拮抗作用是一个活跃的研究领域。本研究中的发现描述了表观遗传修饰和基因组折叠之间的相互作用，它们共同调节mESC转录程序。即，组蛋白乙酰化的急性扰动迅速转化为组蛋白甲基化和3D染色质组织的变化。虽然大多数表观基因组变化是可逆的，但发现3D基因组折叠的某些改变持续存在，并与一部分基因组位点的转录记忆效应相关。
除了启动子处染色质的一般开放和激活外，在TSA处理上观察到广泛的H3K4me1沉积，暗示新增强子的部署。这些可能是基因上调的主要驱动因素，因为先前研究表明增强子景观——而不是启动子活性——对谱系决定更为重要。因此，增强子是基因组中最表观遗传动态的区域，解释了它们对染色质状态平衡破坏的敏感性。有趣的是，发现H3K27乙酰化似乎先于H3K4me1沉积，这对增强子激活中普遍接受的事件序列提出了疑问，其中H3K4me1应该先于H3K27ac。一旦触发，增强子活性的维持是一个主动过程，解释了一旦乙酰化状态恢复，增强子景观和转录程序的有效恢复。发现基因上调发生在E-P接触没有变化的情况下，这与最近将基因激活与增加物理接触频率的需求解耦的研究一致。相反，发现预先存在的E-P接触与记忆效应相关。实际上，认为预形成的E-P接触可能使一些基因预备激活，但需要额外的触发器才能发生转录。推测过量的组蛋白乙酰化激活增强子，那些在结构上与其启动子靶标具有高接触概率的增强子可以在异位乙酰化去除后维持主动转录。
虽然染色质环通常在与E-P接触的背景下讨论，但本研究强调了抑制性染色质环的重要性和效力。反直觉地，发现异位染色质激活增强了以抑制性染色质特征标记的位点之间的环。一类这样的环对应于Polycomb接触，这些接触是TSA诱导的基因表达持续下调的核心。在神经祖细胞中，已知Polycomb位点在顺式中表现出转录记忆，并且这种记忆与PRC2和激活信号之间的拮抗作用相关。因此，一种可能的解释是，异位全基因组染色质激活将激活复合物从Polycomb靶标吸引走，将平衡转向基因下调。关键的是，由于持续的基因下调涉及启动子处H3K27me3-H3K27ac平衡的最小变化（如果有），Polycomb位点的增强空间隔离似乎是抑制机制的核心，构成基于结构的记忆。实际上，Polycomb介导的空间聚类的破坏调节了由TSA触发的转录记忆反应。这与先前的发现一致，表明除了局部染色质压缩外，长程接触是Polycomb复合物赋予沉默的一种机制。还检测到H3K9me3标记位点之间的显著环作为基因下调的潜在机制。研究H3K9me3接触是否由染色质结合蛋白如HP1及其相关伙伴介导可能是有趣的。
急性破坏乙酰化景观也导致全局基因组折叠的重要变化。反式接触的增加指出组蛋白乙酰化可能是染色体内相互作用和染色体领土的重要决定因素。实际上，已经表明长的、高度转录的基因或基因密集区域从染色体领土延伸，尽管这归因于核糖核蛋白与新生转录物的结合，而不是乙酰化状态本身。使用生物物理建模，发现通过增加染色质纤维的刚度，可以概括在TSA中观察到的反式接触比率。广泛接受的是，相同表观遗传状态结构域之间的同型相互作用是染色体区室化的主要驱动力。有趣的是，全局染色质激活削弱而不是加强了A-A区室相互作用，其程度与ESC分化过程中发生的相当。进行的模拟以了解增加的染色质刚度是否会导致过量的反式接触，有效地预测了在Micro-C数据中观察到的区室相互作用的变化。这表明染色质刚度不仅是染色体间接触的重要生物物理决定因素，也是A/B区室化的重要决定因素。
值得注意的是，发现扰动的区室相互作用可以在恢复期后部分持续，表明3D结构携带其过去状态的记忆。这可以通过滞后现象（系统行为对其历史的依赖性）来解释。滞后是3D基因组组织中的一个新兴原则，发现对模拟基因组折叠的某些特征至关重要，并已通过实验证明。此外，生物物理建模表明3D基因组折叠可能是稳定表观遗传记忆的关键元素。本研究进一步支持这些观察，并在全局尺度和基因水平提供了结构记忆的经验证据。
最后，细胞记录先前刺激并触发对后续刺激的增强反应的能力对人类健康具有潜在影响，因为常用的表观药物在治疗期间反复施用。因此，暴露的细胞可能经历多个急性反应随后恢复的循环，潜在地诱导值得进一步研究的长期效应。
